一种用于检测PROTAC分子的重组核酸分子制造技术

本公开属于生物医药技术领域，具体来说，本公开涉及一种用于检测PROTAC分子的重组核酸分子、目标多肽、重组表达载体、重组宿主细胞、重组表达载体、试剂或试剂盒及其用途，以及细胞模型或动物模型的构建方法、药物分子的筛选方法。重组核酸分子编码的多肽在与PROTAC分子结合后，产生检测信号由强向弱的变化，通过获取检测信号的变化即能实现对PROTAC分子的药物功能验证，具有简单、快速、高效等优势，能实现对PROTAC分子的实时、动态跟踪，有利于实现PROTAC药物的大规模药物筛选。现PROTAC药物的大规模药物筛选。现PROTAC药物的大规模药物筛选。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测PROTAC分子的重组核酸分子


[0001]本公开属于生物医药
，具体来说，本公开涉及一种用于检测PROTAC分子的重组核酸分子、目标多肽、重组表达载体、重组宿主细胞、重组表达载体、试剂或试剂盒及其用途，以及细胞模型或动物模型的构建方法、药物分子的筛选方法。

技术介绍

[0002]在传统的药物研发过程中，研究人员通常试图通过靶向调控成千上万种导致疾病的蛋白，进而调节机体功能以达到控制疾病的目的。据估计，约有15％的蛋白能被小分子和生物大分子调控，而高达85％的蛋白无法被现有药物调控。蛋白降解靶向嵌合体(proteolytictargetingchimera，PROTAC)是药物研发领域的一个新兴方向，很多无法用小分子调控或抗体无法到达的靶点可以采用PROTAC技术进行调控。
[0003]PROTAC作为双功能分子，包括三部分：一头是靶向目标蛋白的配体；另一头是可以招募蛋白降解体系的结构(如E3连接酶)；中间通过合适的连接链连接。PROTAC在进入细胞后，其结构中的靶蛋白(proteinofinterest，POI)配体特异性的与靶蛋白结合，另一端E3连接酶配体(E3ligand)与E3连接酶(E3ligase)结合，从而形成POI
‑
PROTAC
‑
E3ligase三元复合物，E3连接酶介导泛素结合酶E2将靶蛋白泛素化，三元复合物解离后，被泛素标记的靶蛋白会被输送到蛋白酶体(proteasome)中降解，从而选择性地降低靶蛋白的水平。此过程无需靶蛋白配体长时间占据结合位点，只需三元复合物短暂的形成便可完成目标蛋白的泛素化，贴有泛素化标签的蛋白能够被蛋白酶体识别并被降解，而且PROTAC在细胞内可多次循环发挥作用。
[0004]蛋白降解靶向嵌合体可特异性地识别靶蛋白，利用细胞内固有的蛋白质降解途径直接在蛋白质水平降解靶蛋白，提高了敲除靶蛋白的效率以及省略了长时间调控过程中产生的中间效应，为研究特定蛋白质的功能和治疗由蛋白异常表达引起的疾病提供了新方法，因此逐渐受到研究者的关注。靶向蛋白质降解技术从诞生起，便不断获得优化，在生物医学研究中得到广泛应用。
[0005]然而，目前PROTAC药物的合成及有效性验证主要使用Western Blot等技术检测靶蛋白的蛋白量变化，存在检测时间长、检测步骤繁琐，且无法实现对PROTAC分子的实时、动态跟踪，不利于对PROTAC药物的大规模药物筛选。

技术实现思路

[0006]专利技术要解决的问题
[0007]鉴于现有技术存在的问题，例如，PROTAC药物的合成及功能检测存在检测时间长、检测步骤繁琐，且无法实现实时、动态跟踪的缺陷。为此，本公开提供了一种重组核酸分子，其编码的多肽在与PROTAC分子结合后，产生检测信号由强向弱的变化，通过获取检测信号的变化即能实现对PROTAC分子的药物功能验证，具有简单、快速、高效等优势，能实现对PROTAC分子的实时、动态跟踪，有利于实现PROTAC药物的大规模药物筛选。
[0008]用于解决问题的方案
[0009]第一方面，本公开提供了一种重组核酸分子，其中，所述重组核酸分子的编码区包含如下核苷酸序列：
[0010]第一序列，所述第一序列编码具有靶蛋白活性的第一多肽；
[0011]第二序列，所述第二序列编码具有泛素连接酶活性的第二多肽；
[0012]连接序列，所述连接序列位于所述第一序列与所述第二序列之间，编码可剪切的连接子；
[0013]第三序列，所述第三序列编码不释放检测信号的第三多肽；
[0014]第四序列，所述第四序列编码不释放检测信号的第四多肽；
[0015]其中，所述第一序列位于所述第三序列与所述连接序列之间，所述第二序列位于所述连接序列与所述第四序列之间；或者，所述第二序列位于所述第三序列与所述连接序列之间，所述第一序列位于所述连接序列与所述第四序列之间；并且，
[0016]所述第三多肽与所述第四多肽相互靠近后，释放出检测信号。
[0017]在一些实施方式中，根据本公开所述的重组核酸分子，其中，所述第一多肽为疾病相关蛋白或其功能片段；可选地，所述第一多肽为肿瘤相关蛋白或其功能片段；
[0018]优选地，所述第一多肽选自如下(a1)
‑
(a2)中的任一项：
[0019](a1)如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽；
[0020](a2)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有SEQ ID NO：1所示的序列活性的多肽；
[0021]优选地，所述第一序列选自如下(a3)
‑
(a5)中的任一项：
[0022](a3)编码(a1)或(a2)所示氨基酸序列的核苷酸序列；
[0023](a4)如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列；
[0024](a5)与SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性，且编码具有SEQ ID NO：1所示序列活性的多肽的核苷酸序列。
[0025]在一些实施方式中，根据本公开所述的重组核酸分子，其中，所述第二多肽选自泛素连接酶或其功能片段；可选地，所述第二多肽选自如下任一种的泛素连接酶或其功能片段：VHL、cIAP1、MDM2、CRBN、SPOP、SKP2、DDB2、SOCS2、ASB1、CHIP；
[0026]优选地，所述第二多肽选自如下(b1)
‑
(b2)中的任一项：
[0027](b1)如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽；
[0028](b2)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有SEQ ID NO：2所示的序列活性的多肽；
[0029]优选地，所述第二序列选自如下(b3)
‑
(b5)中的任一项：
[0030](b3)编码(b 1
)或(b 2
)所示氨基酸序列的核苷酸序列；
[0031](b4)如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；
[0032](b5)与SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列编码的，且编码具有SEQ ID NO：2所示序列活性的多肽的核苷酸序列。
[0033]在一些实施方式中，根据本公开所述的重组核酸分子，其中，所述可剪切的连接子
选自如下(g1)
‑
(g2)中的任一项：
[0034](g1)如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的多肽；
[0035](g2)如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有SEQ ID NO：7所示的序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组核酸分子，其中，所述重组核酸分子的编码区包含如下核苷酸序列：第一序列，所述第一序列编码具有靶蛋白活性的第一多肽；第二序列，所述第二序列编码具有泛素连接酶活性的第二多肽；连接序列，所述连接序列位于所述第一序列与所述第二序列之间，编码可剪切的连接子；第三序列，所述第三序列编码不释放检测信号的第三多肽；第四序列，所述第四序列编码不释放检测信号的第四多肽；其中，所述第一序列位于所述第三序列与所述连接序列之间，所述第二序列位于所述连接序列与所述第四序列之间；或者，所述第二序列位于所述第三序列与所述连接序列之间，所述第一序列位于所述连接序列与所述第四序列之间；并且，所述第三多肽与所述第四多肽相互靠近后，释放出检测信号。2.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其中，所述第一多肽为疾病相关蛋白或其功能片段；可选地，所述第一多肽为肿瘤相关蛋白或其功能片段；优选地，所述第一多肽选自如下(a1)
‑
(a2)中的任一项：(a1)如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽；(a2)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有SEQ ID NO：1所示的序列活性的多肽；优选地，所述第一序列选自如下(a3)
‑
(a5)中的任一项：(a3)编码(a1)或(a2)所示氨基酸序列的核苷酸序列；(a4)如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列；(a5)与SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性，且编码具有SEQ ID NO：1所示序列活性的多肽的核苷酸序列。3.根据权利要求1或2所述的重组核酸分子，其中，所述第二多肽选自泛素连接酶或其功能片段；可选地，所述第二多肽选自如下任一种的泛素连接酶或其功能片段：VHL、cIAP1、MDM2、CRBN、SPOP、SKP2、DDB2、SOCS2、ASB1、CHIP；优选地，所述第二多肽选自如下(b1)
‑
(b2)中的任一项：(b1)如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽；(b2)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有SEQ ID NO：2所示的序列活性的多肽；优选地，所述第二序列选自如下(b3)
‑
(b5)中的任一项：(b3)编码(b1)或(b2)所示氨基酸序列的核苷酸序列；(b4)如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；(b5)与SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列编码的，且编码具有SEQ ID NO：2所示序列活性的多肽的核苷酸序列。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的重组核酸分子，其中，所述可剪切的连接子选自如下(g1)
‑
(g2)中的任一项：(g1)如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的多肽；
(g2)如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有SEQ ID NO：7所示的序列活性的多肽；优选地，所述第三序列选自如下(g3)
‑
(g5)中的任一项：(g3)编码(g1)或(g2)所示氨基酸序列的核苷酸序列；(g4)如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列；(g5)与SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性，且编码具有SEQ ID NO：7所示序列活性的多肽的核苷酸序列。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的重组核酸分子，其中，所述检测信号为荧光信号，所述第三多肽为荧光蛋白的不具有荧光活性的N端片段，所述第四多肽为荧光蛋白的不具有荧光活性的C端片段；优选地，所述第三多肽选自如下(c1)
‑
(c2)中的任一项：(c1)如SEQ ID NO：3或5所示氨基酸序列的多肽；(c2)如SEQ ID NO：3或5所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有SEQ ID NO：3或5所示的序列活性的多肽；优选地，所述第三序列选自如下(c3)
‑
(c5)中的任一项：(c3)编码(c1)或(c2)所示氨基酸序列的核苷酸序列；(c4)如SEQ ID NO：13或15所示的核苷酸序列；(c5)与SEQ ID NO：13或15所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性，且编码具有SEQ ID NO：3或5所示序列活性的多肽的核苷酸序列；优选地，所述第四多肽选自如下(d1)
‑
(d2)中的任一项：(d1)如SEQ ID NO：4或6所示氨基酸序列的多肽；(d2)如SEQ ID NO：4或6所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有SEQ ID NO：4或6所示的序列活性的多肽；优选地，所述第四序列选自如下(d3)
‑
(d5)中的任一项：(d...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄凯，李婧滢，祝新跟，龙小燕，
申请(专利权)人：华东数字医学工程研究院，
类型：发明
国别省市：