巨细胞病毒的gB与五聚体的融合蛋白和包含该融合蛋白的疫苗制造技术

本发明专利技术的目的在于，提供能够预防和治疗CMV感染的有效的疫苗。本发明专利技术的融合蛋白为巨细胞病毒(CMV)的包膜糖蛋白B(gB蛋白)与五聚体的融合蛋白。本发明专利技术的用于预防或治疗巨细胞病毒(CMV)感染的疫苗为包含CMV的包膜糖蛋白B(gB蛋白)与五聚体的融合蛋白作为抗原的亚单位疫苗。位疫苗。位疫苗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】巨细胞病毒的gB与五聚体的融合蛋白和包含该融合蛋白的疫苗


[0001]本专利技术涉及巨细胞病毒的gB与五聚体的融合蛋白、和包含该融合蛋白的用于预防或治疗巨细胞病毒感染的疫苗。

技术介绍

[0002]巨细胞病毒(CMV)感染症主要有下述两种：发生于移植、AIDS、先天性免疫缺陷病等处于免疫抑制状态的患者的CMV肺炎、肠炎、视网膜炎等器官损伤；和，孕妇首次感染时使胎儿发病的先天性CMV感染症。其中，先天性CMV感染症是TORCH综合征之一，是引起胎儿畸形或严重的临床症状的重要的先天性感染症。孕妇在首次感染CMV时，约40％通过胎盘而出现胎儿的先天性感染(本说明书中，以相同含义使用“先天性感染”这一术语和“经胎盘感染”这一术语)。另外，也有报道称死产中约15％是由先天性CMV感染所致。每年先天性感染儿童人数在日本为3000人以上，在美国为约4万人，据称有症状者在日本有约1000人、在美国有约8000人，其中约90％有中枢神经系统疾病、听力损伤等后遗症。
[0003]日本的CMV抗体携带率高于欧美各国，日本成年人的80％～90％为CMV抗体阳性，几乎所有人在婴幼儿期被感染。然而，作为最近的趋势，显示出年轻人的CMV抗体携带率从90％左右降低至60％左右，先天性CMV感染症的预防对策的必要性进一步增高(非专利文献1)。
[0004]美国医学研究所(the Institute of Medicine)认为：在发达国家，先天性CMV感染症作为先天性的中枢神经系统疾病的原因影响已超过唐氏综合症，若以影响到有后遗症的先天性感染儿童的人生的QOL降低和社会经济损失作为质量调整寿命年(QALYs：quality
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adjusted life years)进行计算，据分析认为CMV疫苗属于医疗经济效应最高的一类(非专利文献2)。
[0005]引起感染症的病原体大致分为：通过传统型疫苗能够获得足够的效果的I类病原体、以及通过传统型疫苗或病原体感染经历无法获得足够的免疫防御的II类病原体，CMV属于后者。作为难以克服II类病原体的理由，已经指出了它们所具有的独特的免疫逃逸机制。人类已经开发出许多针对I类病原体有效的疫苗，并战胜了由它们所引起的感染症的威胁。此外，未来疫苗开发的重点正向II类病原体转移。
[0006]为了将先天性CMV感染症所造成的损害减小到最小限度，也进行了通过孕妇筛查来鉴定未感染孕妇、提高日常生活上的防护，但这还不够。进而还有对首次感染孕妇进行鉴定并通过向孕妇给予CMV抗体高效价免疫球蛋白而有效预防胎儿的感染、减轻重症化的报道，但目前对有效性存在质疑(非专利文献3)。另一方面，也有作为低分子药的更昔洛韦(ganciclovir)在市场上销售，但其效果有限，也存在副作用的问题。目前尚不存在疫苗，而且如上所述也没有充分有效的治疗方法，因此对其需求很高。
[0007]关于CMV疫苗开发，一直以来多家制药企业、学术界也尝试使用了减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗等的研究，但任意情况的T细胞免疫、B细胞免疫的应答均不充分，结果无
法获得作为疫苗而耐受实际使用的效果。
[0008]其中，Sanofi公司的疫苗是以CMV糖蛋白的gB作为抗原的基因重组亚单位疫苗，在以未感染成年女性为对象的临床试验中显示出约50％左右的感染预防效果。由于效果是有限的，因此开发实际上被中断，但得到了“单独gB抗原可以显示出一定的效果(但不充分)”这一有意义的见解(非专利文献4)。
[0009]对于候补CMV疫苗的效果的实验性证明，需要考虑CMV的种属特异性。CMV具有种属特异性，因此使用了人巨细胞病毒(HCMV)的动物实验基本上是不可能的。虽使用小鼠、大鼠、豚鼠、猴子等进行了动物实验，但是使用各种动物种属特异性的CMV而实施了动物实验。对于经胎盘感染，仅豚鼠为通过使母体感染病毒、在不进行特殊处理的情况下也能够确认胎儿感染的动物模型系统，广泛利用了豚鼠的经胎盘感染试验系统(非专利文献5)。
[0010]关于gB疫苗对经胎盘感染的效果，报道了：通过向雌豚鼠给予重组豚鼠巨细胞病毒(GPCMV)的gB蛋白+佐剂而抑制了雌豚鼠的首次感染，另外，胎儿的经胎盘感染也得到抑制(非专利文献6)。
[0011]非专利文献7中示出了：使用整合了GPCMV的gB蛋白的腺病毒载体疫苗，在豚鼠的经胎盘感染模型中，gB抑制了胚胎的经胎盘感染。
[0012]另一方面，作为CMV的主要抗原，近年来受到广泛关注的是五聚体(Pentamer)抗原。五聚体是CMV的细胞趋向性决定因子，人CMV是由gH、gL、UL128、UL130和UL131(gH/gL/UL128/UL130/UL131)这5个亚单位构成的分子(非专利文献15)。
[0013]关于五聚体在经胎盘感染中所起的作用，报道了：缺失了五聚体基因的GPCMV已失去对上皮
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内皮细胞的感染性和经胎盘感染能力，通过异位表达所缺失的基因而使这些能力恢复(非专利文献8)。
[0014]另外，关于五聚体疫苗的效果，报道了：对向小鼠给予表达五聚体的载体疫苗MVA
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PC而诱导的单克隆抗体进行了详细地解析，结果与抗gH抗体相比，抗五聚体抗体在上皮和内皮细胞系中的中和能力明显高，被认为在经胎盘感染中重要的滋养层细胞中的中和能力也是同样的(非专利文献9)。
[0015]另一方面，也有相反的报告。非专利文献10中指出：人胎盘中的滋养层祖细胞是CMV的靶标，在CMV感染该细胞时，五聚体的贡献几乎观察不到，而gB的贡献则明确观察到。
[0016]另外，非专利文献11中指出：使用离体的胎盘感染试验系统，在GPCMV感染胎盘组织和增殖中五聚体的贡献几乎观察不到。
[0017]如此，尽管有零散报道表明五聚体作为疫苗抗原是有用的，但五聚体在经胎盘感染中的作用尚不清楚，现状是关于五聚体疫苗对经胎盘感染的抑制效果这一点仍未定论。
[0018]对于五聚体和gB的组合使用的效果，专利文献1中报道了在以猴子为对象的感染防御试验中重组五聚体和重组gB的组合使用是有效的，但对于经胎盘感染的影响没有给出任何启示。另外，虽然显示出五聚体+gB的组合使用组优于五聚体单独组和非免疫组，但由于未设定gB单独组，因此无法准确显示出组合使用的效果。
[0019]另外，非专利文献12中，在体外对抗gB单克隆抗体和抗五聚体单克隆抗体的组合使用效果进行验证，尽管认为在中和能力和抑制耐药菌株出现方面组合使用具有优点，但尚未证实组合使用对生物体中的感染防御能力的效果。
[0020]进而，专利文献2中给出了用gB+五聚体的2价疫苗进行免疫、从而可以使某些细胞
globulin to prevent congenital cytomegalovirus”N Engl J Med 370(2014)1316
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[0035]非专利文献4：Rieder F et al.,“Cytomegalovirus v本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种巨细胞病毒(CMV)的包膜糖蛋白B(gB蛋白)与五聚体的融合蛋白。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，由3个gB蛋白构成分子构成的gB蛋白的同源三聚体和由5个五聚体构成分子构成的五聚体的异源五聚体通过至少1个gB蛋白构成分子与至少1个五聚体构成分子分别以基因工程手段进行融合而形成蛋白复合体。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，至少2个gB蛋白构成分子与至少2个五聚体构成分子分别以基因工程手段进行了融合。4.根据权利要求2或3所述的融合蛋白，其中，3个gB蛋白构成分子与5个五聚体构成分子中的任意3个五聚体构成分子分别以基因工程手段进行了融合。5.根据权利要求2～4中任一项所述的融合蛋白，其中，3个gB蛋白构成分子与作为五聚体构成分子的gL、UL128和UL130分别以基因工程手段进行了融合。6.根据权利要求2～4中任一项所述的融合蛋白，其中，3个gB蛋白构成分子与作为五聚体构成分子的UL128、UL130和UL131分别以基因工程手段进行了融合。7.根据权利要求2～6中任一项所述的融合蛋白，其中，通过基因工程手段的融合中，至少1个融合为五聚体构成分子与gB蛋白构成分子的N末端侧结合的融合。8.根据权利要求3～6中任一项所述的融合蛋白，其中，通过基因工程手段的融合中，至少2个融合为五聚体构成分子与gB蛋白构成分子的N末端侧结合的融合。9.根据权利要求4～6中任一项所述的融合蛋白，其中，3个通过基因工程手段的融合均为五聚体构成分子与gB蛋白构成分子的N末端侧结合的融合。10.根据权利要求2～9中任一项所述的融合蛋白，其中，gB蛋白构成分子与五聚体构成分子之间具有接头和/或标签。11.根据权利要求10所述的融合蛋白，其中，接头为使序列号22中记载的氨基酸序列单元重复1～3次而成的氨基酸序列所构成的接头。12.根据权利要求1～11中任一项所述的融合蛋白，其中，gB蛋白为CMV gB蛋白的胞外域。13.根据权利要求12所述的融合蛋白，其中，gB蛋白为序列号15中记载的氨基酸序列或者在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的人巨细胞病毒(HCMV)的gB蛋白的胞外域。14.根据权利要求12或13所述的融合蛋白，其中，gB蛋白为与序列号15中记载的氨基酸序列所构成的gB蛋白的胞外域具有80％以上的序列同一性的gB蛋白的胞外域。15.根据权利要求1～14中任一项所述的融合蛋白，其中，gB蛋白为缺失了结构域IV的gB蛋白变体。16.根据权利要求15所述的融合蛋白，其中，gB蛋白为序列号16中记载的氨基酸序列或者在该氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上氨基酸残基而成的氨基酸序列所构成的人巨细胞病毒(HCMV)的gB蛋白的胞外域。17.根据权利要求15或16所述的融合蛋白，其中，gB蛋白为与序列号16中记载的氨基酸序列所构成的gB蛋白的胞外域具有80％以上的序列同一性的gB蛋白的胞外域。18.根据权利要求1～14中任一项所述的融合蛋白，其中，gB蛋白为与野生型gB蛋白相比导入了减少聚集体的形成、增加同源三聚体结构的比例的改变的gB蛋白变体。19.根据权利要求18...

【专利技术属性】
技术研发人员：鸟饲正治，森泰亮，枦山纮辅，松本美幸，
申请(专利权)人：KM生物医薬股份公司，
类型：发明
国别省市：