突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物工程技术领域，尤其是涉及突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白及其应用。本发明专利技术提供的突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白，相较于野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白存在以下突变：(a)F1亚基和/或F2亚基中至少一个氨基酸残基被半胱氨酸取代，(b)野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白第104～144位氨基酸残基被连接肽部分或全部取代，所述连接肽的氨基酸残基长度至少2个。本发明专利技术中所述一种突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白相比于同类品具有优异的中和抗体结合活性和热稳定性，适宜于开发成为呼吸道合胞病毒疫苗的组分之一。发成为呼吸道合胞病毒疫苗的组分之一。发成为呼吸道合胞病毒疫苗的组分之一。

【技术实现步骤摘要】
突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白及其应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，尤其是涉及突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)是引起婴幼儿、老年人及免疫功能缺陷患者下呼吸道感染的重要病原体。2020年，全球5岁以下儿童中呼吸道合胞病毒严重感染人数高达3460万人，其中仅中国的感染人数就达到300万人。每年大约3％～7％的60岁以上老年人会受到RSV感染。老年人因为免疫力下降和基础疾病，出现严重疾病的风险更高。WHO估计每年全球有6400万儿童感染呼吸道合胞病毒，其中15万儿童死于呼吸道合胞病毒感染，且同时引起非常严重的全球医疗负担，据估计2017年全球与RSV相关的直接医疗费用为48.2亿欧元。呼吸道合胞病毒感染可导致严重并发症，包括毛细支气管炎或肺炎，通常伴有急性呼吸窘迫，需要住院治疗。天然的RSV感染不会引起长期的免疫保护，且会反复感染。目前只有一种已获许可的单克隆抗体产品(Palivizumab)用于降低高危新生儿严重疾病的发生率。近30多年来尚无有效的RSV疫苗上市，安全有效的RSV疫苗开发一直被视为非常具有挑战性。因此，呼吸道合胞病毒疫苗已被WHO列为全球最优先发展的疫苗之一。
[0003]RSV感染主要由糖蛋白F和G介导，黏附蛋白(G)与宿主细胞膜黏附，促使病毒吸附于细胞表面，融合蛋白(F)介导病毒包膜与宿主细胞膜融合，使病毒进入细胞，在病毒融合和进入期间，F蛋白从亚稳定的融合前构象(pre
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F)转变为稳定的融合后构象(post
‑
F)。F蛋白序列在不同亚型间较为保守，是RSV疫苗开发的重要抗原靶点。RSV F蛋白属于Ⅰ型融合蛋白，主要包括以下几个功能区：信号肽(1～26aa)位于F蛋白N端，负责将F蛋白引导至细胞膜表面；两个弗林蛋白酶切位点，主要由碱性氨基酸组成的蛋白酶识别位点分别为酶切位点1(KKRKRR，FCS1)和酶切位点2(RARR，FCS2)；融合肽FP(137～146aa)由19个氨基酸组成，F蛋白的三聚体激活时，融合肽负责插入到相邻的细胞的细胞膜；七肽重复区HRA(146～216aa)和HRB(460～514aa)，在膜融合过程中，HRA和HRB形成稳定的6HB结构；跨膜区(514～574aa)，F蛋白嵌入膜内的区域；CT区，F蛋白位于细胞质内的区域，其可与病毒的M蛋白相互作用，与病毒的包装和出芽有关。
[0004]F蛋白首先合成蛋白前体F0，在细胞融合过程中，经弗林蛋白酶酶切后释放一个由27个氨基酸组成的多肽pep27(109～127aa)，形成以二硫键相连接的F1片段和F2片段，从不稳定的融合前构象转变为稳定的融合后构象。比较融合前后RSV F蛋白结构表明，大多数二级和三级结构在融合前和融合后状态下都得到保留，相比之下，F1亚基N端和C端的区域显示出明显的构象变化。位于F1亚基N端的融合肽和五个二级结构元件(α2、α3、α4螺旋和β3、β4折叠)重新排列并与α5螺旋融合，形成的单延伸融合后螺旋(α5post)。在F1亚基C末端，唯一的平行链(β22)散开，使融合前α10螺旋向α5post螺旋移动，以促进膜融合。
[0005]近年来，随着F蛋白的构象转变过程逐渐被揭示，融合前构象的F蛋白具有90％以上中和活性的Φ表位被发现，同时用于稳定preF结构的突变位点改造也得到证实，稳定的
preF蛋白突变体作为疫苗抗原可以激活更高效的中和抗体。因此，开发稳定的融合前构象F蛋白抗原成为RSV疫苗研发的新目标。以结构生物学为基础开发的稳定融合前构象F蛋白疫苗也已进入临床阶段。杨森制药公司(Janssen)的“SC
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TM”结构通过三个点突变(N67I、S215P、E487Q)并将pep27区域替换为连接肽的方式获得了中和活性较高的融合前构象(DOI:10.1038/ncomms9143)。美国国家过敏和传染病研究所(NIAID)的团队开发的第一个融合前构象F蛋白“DS
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Cav1”，通过在F1片段内S155C和S290C点突变获得分子内二硫键，同时加入S190F和V207L点突变以增强关键中和表位的结合活性(DOI:10.1126/science.1243283)。在辉瑞公司公开专利(CN201680075615.8)实施例中提到的一种突变体“pXCS852”在保留pep27的基础上通过加入S55C和L188C分子内二硫键，以及T54H和D486S点突变用于增强融合前构象的稳定性和表位活性。
[0006]理想的融合前构象F蛋白突变体设计应具备以下几点特性：(1)维持融合前F蛋白三聚体的构象以获得正确的中和表位；(2)高表达量的三聚体蛋白以诱导产生足够的免疫反应并满足产业化制造需求，即F蛋白应具有高效的表达能力和自组装能力；(3)具有高稳定化的三聚体构象以持续保持融合前构象，保持原始或较高的免疫活性，满足生产制剂等需求。
[0007]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白，期望该突变蛋白能够具有稳定的融合前构象和高表达量，并可形成稳定的三聚体，从而可用于呼吸道合胞病毒感染的预防、诊断和治疗。
[0009]为解决上述技术问题，实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白，所述突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白相较于野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白存在以下突变：
[0011](a)F1亚基和/或F2亚基中至少一个氨基酸残基被半胱氨酸取代，并且该取代使得呼吸道合胞病毒融合前F蛋白F1亚基与F2亚基间存在非天然二硫键连接，所述非天然二硫键包括F1亚基与F2亚基之间形成的除Cys69
–
Cys212和Cys37
–
Cys439之外的二硫键；
[0012](b)野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白第104～144位氨基酸残基被连接肽部分或全部取代，所述连接肽的氨基酸残基长度至少2个；
[0013]所述野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.01所示。
[0014]需要说明的是，所述“部分或全部取代”是指野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白第104～144位氨基酸残基可以被全部取代或者其中某些片段被部分取代，举例但不限于“第104～110位”、“第104～120位”、“第104～130位”、“第104～137位”、“第110～130位”或“第120～144位”。
[0015]在可选的实施方式中，所述半胱氨酸取代包括S55C、T189C、P101C或V152C中至少一种。
[0016]在可选的实施方式中，所述半胱氨酸取代包括S55C和T189C，和/或，P101C和V152C。
[0017]在可选的实施方式中，野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白第104～1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白，其特征在于，所述突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白相较于野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白存在以下突变：(a)F1亚基和/或F2亚基中至少一个氨基酸残基被半胱氨酸取代，并且该取代使得呼吸道合胞病毒融合前F蛋白F1亚基与F2亚基间存在非天然二硫键连接，所述非天然二硫键包括F1亚基与F2亚基之间形成的除Cys69
–
Cys212和Cys37
–
Cys439之外的二硫键；(b)野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白第104～144位氨基酸残基被连接肽部分或全部取代，所述连接肽的氨基酸残基长度至少2个；所述野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.01所示。2.根据权利要求1所述的突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白，其特征在于，所述半胱氨酸取代包括S55C、T189C、P101C或V152C中至少一种。3.根据权利要求2所述的突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白，其特征在于，所述半胱氨酸取代包括S55C和T189C，和/或，P101C和V152C。4.根据权利要求1～3任一项所述的突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白，其特征在于，野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白第104～137位氨基酸残基被连接肽全部取代。5.根据权利要求4所述的突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列为GSGSGGSGSGRS。6.根据权利要求1～3任一项所述的突变型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白，其特征在于，野生型呼吸道合胞病毒融合前F蛋白第104～144位氨基酸残基被连接肽全部取代，所述连接肽的氨基酸序列为GSGSGRS或GS。7....

【专利技术属性】
技术研发人员：张建城，陈晓雨，易晓男，阮宝阳，刘林，石照蓉，曹玉锋，史力，
申请(专利权)人：怡道生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：