一种RSV融合前F蛋白、表达质粒、细胞株和RSV疫苗组合物制造技术

本发明专利技术提供了一种RSV融合前F蛋白、表达质粒、稳定表达融合前F蛋白的细胞株和RSV疫苗组合物，涉及生物医药技术领域。本发明专利技术在融合前F蛋白基础上引入N70Q突变位点，消除该糖基化位点并增强免疫原性，并以GCN4基序替换跨膜区和胞内区形成稳定的分泌型三聚体从而获得分泌型三聚体化的融合前F蛋白(NQ)。本发明专利技术利用真核表达的方法，成功构建了稳定表达所述融合前F蛋白NQ的CHO细胞系，将表达的NQ和佐剂(Al(OH)3+CpG

【技术实现步骤摘要】
一种RSV融合前F蛋白、表达质粒、细胞株和RSV疫苗组合物


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种RSV融合前F蛋白、表达质粒、细胞株和RSV疫苗组合物。

技术介绍

[0002]人呼吸道合胞病毒(Humanrespiratory syncytial virus，RSV)是导致婴幼儿、老年人和免疫力低下成年人下呼吸道感染(Lower respiratory tract infections，LRTI)的最重要病毒病原，几乎100％的婴幼儿在2岁以内感染过1次以上。在1月至1岁儿童全因死亡的单病原感染因素分析中，RSV引起的死亡人数约占总死亡人数的6.7％，排列第二位。RSV还是导致5岁以下的儿童因肺炎死亡的最重要病毒病原。因此，急需RSV疫苗降低RSV感染和RSV相关死亡人数，但是经过多年不懈努力，RSV的预防及治疗依然缺乏有效、可靠的方法。因此WHO将RSV疫苗列为二十一世纪应优先发展的疫苗。研发可用于预防RSV感染的疫苗，必将有助于提高婴幼儿和老年人的健康水平、助力实现健康中国的发展战略。
[0003]随着人们对RSV免疫逃逸机制的深入认识，以及对FI
‑
RSV引起ERD原因的逐步理解，随着疫苗研究技术和方法的日益丰富，以限制病毒复制和降低RSV感染后严重下呼吸道症状为目的的RSV疫苗研制工作已看到希望，在亚单位疫苗(Subunitvaccine)及活疫苗(Live virus vaccine)的研究上取得了有意义的进展。亚单位疫苗是指由纯化的一种或几种RSV病毒蛋白组成的非复制型疫苗，能产生很好的抗体应答，但对新生儿仍存在疾病增强作用的风险，适宜于RSV血清阳性儿童、孕妇和老年人群提高免疫力，但是目前没有针对RSV的亚单位疫苗上市。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种RSV融合前F蛋白、表达质粒、细胞株和RSV疫苗组合物，所述RSV疫苗组合物能够诱导产生了Th1/Th2平衡免疫应答、高滴度的中和抗体，以及细胞免疫，为研制RSV亚单位疫苗奠定基础。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种呼吸道合胞病毒融合前F蛋白NQ，所述融合前F蛋白NQ为在呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的氨基酸序列中引入N70Q突变位点，并以GCN4基序替换跨膜区和胞内区。
[0007]优选的，所述融合前F蛋白NQ的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术还提供了一种包含上述融合前F蛋白NQ的编码基因的表达质粒，所述表达质粒以真核表达质粒pMEW为基础载体；
[0009]所述真核表达质粒pMEW的制备方法，包括配利用MAR、EF
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1a启动子、BGH poly(A)和WPRE的基因序列替换pcDNA3.1(+)的CMV启动子、多克隆位点和SV40 poly(A)序列。
[0010]优选的，所述真核表达质粒PMEW的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]本专利技术还提供了上述表达质粒的构建方法，包括以下步骤：将上述融合前F蛋白的
编码基因插入真核表达质粒pMEW的EcoRV和SpeI酶切位点之间。
[0012]本专利技术还提供了一种稳定表达上述融合前F蛋白NQ的细胞株，所述细胞株以CHO细胞株为基础细胞。
[0013]本专利技术还提供了上述细胞株的构建方法，包括以下步骤：利用上述表达质粒转染CHO细胞，筛选获得稳定表达融合前F蛋白NQ的CHO细胞株。
[0014]本专利技术还提供了上述融合前F蛋白NQ或上述表达质粒或上述细胞株在制备抗呼吸道合胞病毒感染的制剂中的应用。
[0015]本专利技术还提供了一种预防呼吸道合胞病毒感染的疫苗组合物，所述疫苗组合物包括上述融合前F蛋白NQ或利用上述重组细胞株生产得到的融合前F蛋白和佐剂(Al(OH)3+CpG
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X1)。
[0016]优选的，所述佐剂的类型包括CpG
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X1和Al(OH)3。
[0017]有益效果：本专利技术提供了一种呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的融合前F蛋白(NQ)，在融合前F蛋白(SC
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TM)基础上引入N70Q突变位点，消除该糖基化位点增强免疫原性，从而获得新的preF(NQ)。本专利技术利用真核表达的方法，成功构建了稳定表达NQ的CHO细胞系，将表达的NQ和佐剂组合后，制备疫苗组合物。
[0018]本专利技术实施例中，将制备得到的疫苗组合物，经肌肉注射免疫小鼠诱导产生了Th1/Th2平衡免疫应答、高滴度的中和抗体，以及细胞免疫，为研制RSV亚单位疫苗奠定基础。
附图说明
[0019]图1为本专利技术实施例所述的血清ELISA抗体；
[0020]图2为本专利技术实施例所述的血清中和抗体；
[0021]图3为本专利技术实施例所述的血清IgG1和血清IgG2a；
[0022]图4为本专利技术实施例所述的细胞免疫。
具体实施方式
[0023]本专利技术提供一种呼吸道合胞病毒融合前F蛋白NQ，所述融合前F蛋白为NQ在呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的氨基酸序列中引入N70Q突变位点，并以GCN4基序替换跨膜区和胞内区。本专利技术通过引入所述N70Q突变位点，可消除该糖基化位点并增强免疫原性，本专利技术通过用GCN4基序替换跨膜区和胞内区形成稳定的分泌型三聚体。本专利技术所述融合前F蛋白NQ的编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示。本专利技术所述呼吸道合胞病毒融合前F蛋白已在中国专利CN202010863762.X中进行公开，在此不再赘述。
[0024]本专利技术还提供了一种包含上述融合前F蛋白NQ的编码基因的表达质粒，所述表达质粒以真核表达质粒pMEW为基础载体；
[0025]所述真核表达质粒pMEW的制备方法，包括配利用MAR、EF
‑
1a启动子、BGH poly(A)和WPRE的基因序列替换pcDNA3.1(+)的CMV启动子、多克隆位点和SV40 poly(A)序列。
[0026]本专利技术所述替换优选包括利用MluⅠ和PmeⅠ双酶切pcDNA3.1(+)后，与人工合成包含MAR、EF
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1a启动子、BGH poly(A)和WPRE的基因序列连接，从而获得真核表达质粒pMEW。本专利技术所述真核表达质粒PMEW的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示。
[0027]本专利技术所述表达质粒以pMEW为基础载体，并将所述融合前F蛋白NQ的编码基因插入真核表达质粒pMEW的EcoRV和SpeI酶切位点之间，从而构建得到所述表达质粒。本专利技术对所述MluⅠ和PmeⅠ双酶切及EcoRV和SpeI双酶切的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规双酶切方法即可。
[0028]本专利技术还提供了上述表达质粒的构建方法，包括以下步骤：将上述融合前F蛋白NQ的编码基因插入真核表达质粒pMEW的EcoRV和SpeI酶切位点之间。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种呼吸道合胞病毒融合前F蛋白NQ，其特征在于，所述融合前F蛋白NQ为在呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的氨基酸序列中引入N70Q突变位点，并以GCN4基序替换跨膜区和胞内区。2.根据权利要求1所述融合前F蛋白NQ，其特征在于，所述融合前F蛋白NQ的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.一种包含权利要求1或2所述融合前F蛋白NQ的编码基因的表达质粒，所述表达质粒以真核表达质粒pMEW为基础载体；所述真核表达质粒pMEW的制备方法，包括配利用MAR、EF
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1a启动子、BGH poly(A)和WPRE的基因序列替换pcDNA3.1(+)的CMV启动子、多克隆位点和SV40 poly(A)序列。4.根据权利要求3所述表达质粒，其特征在于，所述真核表达质粒PMEW的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。5.权利要求3或4所述表达质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1或2...

【专利技术属性】
技术研发人员：付远辉，何金生，郑妍鹏，彭向雷，虞结梅，
申请(专利权)人：北京交通大学，
类型：发明
国别省市：