【技术实现步骤摘要】
一种预防呼吸道合胞病毒的rAAV载体疫苗
[0001]本专利技术涉及一种预防呼吸道合胞病毒RSV的rAAV载体疫苗。
技术介绍
[0002]呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）于1955年首次被发现（Morris et al，1956），属于副黏病毒科（Paramyxoviridae），肺炎病毒亚科（Pneumovirinae），肺炎病毒属（Pneumovirus），依据G蛋白的序列分A和B两个亚型。RSV广泛在世界各地广泛流行，是全球范围内引起呼吸道感染（Respiratory tract infection，RTI）的病毒性病原体，是导致5岁以下儿童和老人呼吸系统疾病住院的最主要原因，感染主要引起下呼吸道感染症状，其中严重症状的患者占有相当高的比例（如毛细支气管炎和肺炎），需要住院治疗，具有较高的死亡率。RSV也可感染成年人，引起的症状及危害比流感还严重。对于患有先天性心脏病、慢性肺病和特异性病史等人群，RSV感染的风险也大大增加。RSV在全球范围内广泛传播和流行，已经成为世界性的公共卫生问题，RSV的危害已经引起了世界卫生组织（WHO）以及全球各级卫生管理部门的高度关注和重视。
[0003]RSV为非节段性的负链RNA病毒，其基因组长度为15.2kb，有10个基因，共编码11种蛋白，包括非结构蛋白（NS1，NS2）、核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、RNA 依赖RNA 聚合酶（L）、转录延伸因子（M2
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1）、调控因子（M2>‑
2）和3种包膜糖蛋白（黏附蛋白（G）、融合蛋白（F）和小疏水蛋白（SH））。病毒为100
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350nm的球形颗粒，但通常占主导地位的病毒颗粒是直径为60～200nm，长度大于10μm的丝状结构。RSV可以通过人与人之间接触传播，或者通过咳嗽或打喷嚏而吸入传播，也可通过接触污染物而获得感染，主要感染鼻腔以及肺部大、小气道的上皮细胞，也可能感染肺泡巨噬细胞和肺部其它类型的细胞，可引起细胞融合在一起形成合胞体。
[0004]RSV包膜下面有N、P、L、M和M2
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1蛋白，而F、G和SH蛋白表达在病毒包膜表面，由于F蛋白为融合蛋白，感染细胞后产生独特的细胞融合病变；G蛋白为吸附性蛋白，可与细胞表面的受体结合；F蛋白为典型的副粘病毒融合性糖蛋白，由F1和F2两段蛋白组成，中间由弗林蛋白酶（Furin）酶切位点相连；F1的N端是由连续的19个疏水氨基酸组成的具有融合活性的肽段，C端由连续23个疏水氨基酸组成的肽段，介导病毒与细胞膜融合、病毒的穿入及合胞体的形成；而G蛋白与RSV感染的机理有关，并决定了RSV抗原的多样性。
[0005]RSV感染主要是由病毒表面F、G蛋白引发，刺激机体产生血清中和抗体及呼吸道黏膜的分泌型IgA；F蛋白在诱发免疫保护、高水平血清中和抗体方面起着重要作用；同时RSV F和G蛋白，是激发机体产生保护性抗体的最主要的抗原，且G蛋白所诱导的中和抗体具有型特异性；F蛋白高度保守，中和抗体识别位点主要分布于F1片段，且所诱导的中和抗体可同时抑制A、B两个亚型的病毒感染。小疏水蛋白（SH）是另一个可能的疫苗靶点，包含跨膜结构域和胞外结构域，与病毒在体内的复制和炎症激活方面起作用，可能诱导抗体依赖的细胞介导细胞毒作用（ADCC），因此，其胞外域已被用作抗原研究也具有潜在的应用价值。
[0006]疫苗研究是目前RSV防治研究最为集中的领域，早在20世纪60年代，福尔马林灭活
RSV疫苗（FI
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RSV）被研制出来进行临床研究，这也是首个进入临床试验的RSV疫苗，但该疫苗不仅没有产生对RSV疾病的保护作用，且在后来的自然感染中，接种过疫苗的儿童发生了严重的疾病增强（ERD）现象，住院率明显增加，甚至引起死亡，因此，该疫苗最终未能进入临床应用。
[0007]近年对RSV疫苗研究的方向更加的广泛和深入，包括减毒活疫苗、灭活疫苗、嵌合载体疫苗、亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗、复制缺陷型病毒载体疫苗、核酸疫苗等作为候选疫苗，目前都处于临床前或临床试验阶段，其中减毒活疫苗、重组蛋白疫苗和嵌合载体疫苗是近年RSV疫苗研究的热点方向；而G蛋白和F蛋白能够诱发良好的体液免疫和细胞免疫反应，是重组蛋白疫苗技术的主要目标抗原。
[0008]基于RSV的F蛋白和G蛋白开发的亚单位疫苗能够诱导产生中和抗体和保护性抗体，用它们制备的亚单位疫苗包括特异性G蛋白或纯化F蛋白，由于F蛋白相当保守，在疫苗应用研究中更受欢迎，而基于这F和G两种蛋白的亚单位疫苗和减毒活疫苗最有前途，已经被应用于临床研究试验阶段；重组RSV纳米颗粒疫苗，是由F蛋白组成的低聚物颗粒，不仅可诱导高活性的中和抗体，还能够防止肺部感染，可用于母婴传递和老年人预防RSV的感染；表达RSV F蛋白和G蛋白的腺病毒载体和痘病毒载体疫苗，能够诱导良好的体液免疫和细胞免疫反应，且无ERD现象，也是理想的疫苗候选疫苗品种；开发编码RSV抗原的DNA或mRNA的核酸疫苗的目标是能够有效保护儿童和老年人群RSV的感染。
[0009]目前，RSV疫苗是市场呼声最高的疫苗产品之一，也是WHO疫苗研发计划大力支持和倡导的品种。近些年，随着反向遗传学、疫苗学、分子病毒学、基因组学、免疫学等技术水平的不断提升和发展，预防RSV感染的疫苗开发也取得了重大的突破，许多的产品在临床研究试验阶段表现出了良好免疫原性和临床应用潜力。
[0010]腺相关病毒（adeno
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associated virus，AAV）属于细小病毒属，病毒颗粒直径为22nm左右，属于复制缺陷型二十面体无包膜单链DNA病毒，已经发现的AAV血清型有12种，目前，还未发现AAV对人类致病。但不同的AAV载体具有不同的衣壳蛋白空间结构、序列和组织特异性。重组AAV以衣壳为载体，将病毒包装的基因组传送到细胞核进行复制。AAV具有三层蛋白质外壳（VP1、VP2和VP3），包围并保护一个约4.7kb大小的单链DNA基因组。
[0011]对野生型AAV进行基因工程改造的重组型AAV是基因传递和表达的一个重要载体，其具有广泛的宿主范围及组织感染能力，既能感染分裂细胞，也能转导外源基因进入非分裂细胞，长期表达外源基因，而不依赖于宿主细胞活跃的分裂能力。
[0012]rAAV相对于其它病毒载体具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广，能稳定表达和物理性质稳定的优点。目前，已有3款基于AAV载体的基因药物在国外批准上市，并且有多个基于AAV的药物在临床研究阶段，因此，AAV载体被美国FDA认为是用于人体基因治疗的最安全的病毒载体之一。而根据文献报道（Karen Nieto and Anna Salvetti），基于AAV载体的疫苗可以稳定在体内表达抗原，并能够诱导机体产生持久和稳定的免疫反应。
[0013]RSV疫苗面临的最重要难点目前认为是免疫持续的时间短以及诱导的Th1和Th2免疫反应不平衡的问题，而基于rAAV载本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种RSV抗原，其氨基酸序列选自如下述氨基酸序列的至少一条，或者至少具有90%、95%、98%、99%同源性的氨基酸序列：RSV F抗原多肽序列，能够诱导针对F蛋白、F1、F2蛋白的特异性抗体及针对RSV的中和抗体和免疫保护效果，选自：使用连接序列GS替代F蛋白Furin位点氨基酸得到的融合蛋白；使用连接序列GS替代F蛋白Furin位点及其后融合区连接的10个氨基酸得到的融合蛋白；使用2A连接序列替代F蛋白Furin位点氨基酸得到的抗原多肽；使用2A连接序列替代F蛋白Furin位点及其后融合区连接的10个氨基酸得到的抗原多肽；F1蛋白的C
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末端残基添加Foldon三聚化结构域得到的抗原多肽；F1蛋白的N
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末端添加IgE信号肽序列、C
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末端残基添加Foldon三聚化结构域得到的抗原多肽；F蛋白Furin B酶切位点突变为KKQKQQ得到的抗原多肽；RSV G抗原多肽序列，能够诱导针对G蛋白的特异性抗体及针对RSV的中和抗体和免疫保护效果，选自：在RSV的G蛋白的N
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末端添加IgE信号肽序列得到的抗原多肽；RSV SH抗原多肽序列，能够诱导针对SH蛋白的特异性抗体及针对RSV的中和抗体和免疫保护效果，选自：RSV的SH蛋白与免疫球蛋白IgG Fc区的融合蛋白；优选的，SH蛋白与免疫球蛋白IgG Fc区通过连接序列偶连；优选的，所述连接序列紧邻SH C
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末端与Fc的N
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末端，选自长度为1～20 aa的合适序列；特别的，所述连接序列的氨基酸序列选自GGGSGGGSGGGSGS、GGGSGGGS、GGGSGGGSGG、GGGSGGGSGGGS。2.根据权利要求1所述的RSV抗原，其特征在于：连接序列GS为GS连接子，优选的，其氨基酸序列选自GGGSGGGSGGGSGS、GGGSGGGS、GGGSGGGSGG、GGGSGGGSGGGS；2A连接序列的氨基酸序列为含D
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X
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E
【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书二页说明书九页序列表五页附图五页，
申请(专利权)人：广州更新生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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