一种维生素25（OH）D3异构体的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种维生素25(OH)D3异构体的检测方法，属于维生素检测方法技术领域，将标准品稀释为20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL和0.625ng/mL6个浓度，C3异构体同位素内标稀释为100ng/mL溶液备用，将准确定量测定C3

【技术实现步骤摘要】
一种维生素25（OH）D3异构体的检测方法


[0001]本专利技术涉及一种维生素检测方法，特别是涉及一种维生素25 (OH)D3异构体的分离与检测方法，属于维生素检测方法


技术介绍

[0002]维生素D是类固醇衍生物，主要生理作用是调节钙的代谢，从而维持骨骼健康。
[0003]维生素D也可通过噬菌作用而增强免疫力，在抗肿瘤活性和免疫功能调节方面发挥着重要作用。
[0004]最新的研究指出，除骨质疏松、龋齿、儿童佝偻病等“经典”维生素D缺乏病外，多种慢性病的发生均与维生素D缺乏有关。
[0005]人体中的维生素D在肝脏内被25
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羟基氧化酶氧化成25
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羟基维生素D(25OHD)，25OHD是维生素D在人体内的主要循环形式。
[0006]部分25OHD经由肾脏再进一步的羟基化作用，转变为 1,25
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(OH)2D。1,25
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(OH)2D是维生素D的活性形式，维生素D的主要生理功能通过该形式实现，但是其在人体内的半衰期较短(3
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4 小时)，且浓度受多种因素影响，其浓度不能准确反映人体维生素D 的营养水平。
[0007]25OHD是维生素D在体内的稳定存在形式，半衰期较长(约2 周)，因此其含量能客观的反映人体内维生素D的水平，可对25OHD 的浓度进行检测来评价人体的维生素D营养水平。
[0008]25OHD主要包括25OHD2(麦角钙化醇)和25OHD3(胆钙化醇)。两者获取途径不同。维生素D2不能由人体自身合成，只能从外界摄取，多含于植物性食物中，由植物的麦角固醇经阳光照射合成。
[0009]25OHD3可由人体皮肤和脂肪组织在7
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脱氢胆固醇经阳光照射后合成，亦可通过从食物中摄取，主要存在于奶类、乳制品类、深海鱼类以及动物肝脏中。
[0010]越来越多的证据表明，25OHD2与25OHD3对骨骼健康同样有效。因此，临床和实验室专家建议应同时检测25OHD2和25OHD3，从而确保维生素D状态得到全面评价。
[0011]最近发现维生素D代谢物可以通过C3差向异构化途径进一步代谢。
[0012]25OHD3在肝脏中经历差向异构化过程，产生3
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epi
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25
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羟基维生素D3[3
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epi
‑
25OHD3，C3
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epi]，该异构体存在于99％样本中(从新生儿到80岁以上受试者)。
[0013]C3
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epi是25OHD3的一种立体异构体，与25OHD3仅在C3位置不同，其中羟基位于α方向而不是β方向。
[0014]C3
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epi的生理作用尚不清楚，但有体外数据表明，这种异构体对甲状旁腺激素的抑制作用与25OHD3相当。
[0015]因此，探讨C3
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epi含量与人生理病理功能之间的关系越发重要，但是，由于C3差向异构体的质量和裂解模式与25(OH)D3的质量和裂解模式相同，因此当两种代谢物未经色谱分解时，会导致无法定量计算C3
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epi含量以及高估25OHD3水平，这些发现对将25OHD3与其
异构体分开进行特异性检测提出了挑战。
[0016]目前维生素D在临床实验室检测中常用的检测方法为免疫学法 (包括放射免疫学法、酶联免疫学法和化学发光免疫法等)和近年来新兴的串联质谱法。
[0017]前者只能检测总25OHD(即25OHD2与25OHD3之和)，无法分开检测25OHD2和25OHD3，更无法定量检测C3
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epi，且VitD结合蛋白释放效率(疏水性)、代谢物中间产物的交叉反应、异嗜性抗体的干扰或缺乏国际标准等因素导致各种免疫分析方法间的变异太大，测定结果不准确。
[0018]与传统方法相比，串联质谱法定量测定25OHD具有更好的特异性和更强的抗干扰性，并能实现25OHD2与25OHD3的同时准确测定。
[0019]但是，目前大部分串联质谱分离方法无法有效区分25OHD3和 C3
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epi。本专利技术提供一种维生素25(OH)D3异构体的检测方法来解决上述问题。

技术实现思路

[0020]本专利技术的主要目的是为了提供一种维生素25(OH)D3异构体的检测方法，将准确定量测定C3
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epi水平，提高维生素D测定的准确度。
[0021]本专利技术的目的可以通过采用如下技术方案达到：
[0022]一种维生素25(OH)D3异构体的检测方法，步骤1：将标准品稀释为20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL和 0.625ng/mL6个浓度，C3异构体同位素内标稀释为100ng/mL溶液备用；
[0023]步骤2：准确吸取200μL标准品溶液于2mL离心管中，分别加入10μL内标溶液，涡旋混匀后瞬时离心；
[0024]步骤3：再加入1mL释放剂，涡旋5分钟；高速离心5分钟后吸取800μL上清液至2mL离心管中；
[0025]步骤4：用氮吹仪吹干；再加入125μL复溶液(65％甲醇水溶液)，涡旋5分钟；高速离心5分钟后取上清液100μL供色谱分析进样分析；
[0026]步骤5：准确吸取200μL血清/血浆样本于2mL离心管中，分别加入10μL内标溶液，涡旋混匀后瞬时离心；
[0027]步骤6：再加入1mL释放剂，涡旋5分钟；高速离心5分钟后吸取800μL上清液至2mL离心管中；
[0028]步骤7：用氮吹仪吹干；再加入125μL复溶液，涡旋5分钟；高速离心5分钟后取上清液100μL供色谱分析进样分析；
[0029]步骤8：将处理好的标准品和血清/血浆样品各100μL注入96 孔进样板中，覆上铝箔封膜，启用应用软件，建立样品列表，放入高效液相色谱
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串联质谱仪进行检测，并记录质谱图与检测样品中C3 异构体峰面积与相应内标峰面积；
[0030]步骤9：打开MultiQuantTM或Quantification软件，点击工具栏中的Creates a new Results Table，选择相应数据进行结果分析。以标准品浓度为横坐标，以标准品峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，制作标准曲线，将样品与内标的峰面积比代入方程，计算血清样本中维生素含量。
[0031]优选的，其中步骤2中10μL内标溶液为100ng/mL C3异构体同位素内标。
[0032]优选的，其中步骤3中1ml释放剂为叔丁基甲基醚，步骤3中所述高速离心转速为13000转/分钟。
[0033]优选的，步骤4中125μL复溶液为65％甲醇水溶液，步骤4中所述高速离心转速13000转/分钟。
[0034]优选的，其中步骤9中将标准品作为样品，对每个样本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种维生素25(OH)D3异构体的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1：将标准品稀释为20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL和0.625ng/mL6个浓度，C3异构体同位素内标稀释为100ng/mL溶液备用；步骤2：准确吸取200μL标准品溶液于2mL离心管中，分别加入10μL内标溶液，涡旋混匀后瞬时离心；步骤3：再加入1mL释放剂，涡旋5分钟；高速离心5分钟后吸取800μL上清液至2mL离心管中；步骤4：用氮吹仪吹干；再加入125μL复溶液(65％甲醇水溶液)，涡旋5分钟；高速离心5分钟后取上清液100μL供色谱分析进样分析；步骤5：准确吸取200μL血清/血浆样本于2mL离心管中，分别加入10μL内标溶液，涡旋混匀后瞬时离心；步骤6：再加入1mL释放剂，涡旋5分钟；高速离心5分钟后吸取800μL上清液至2mL离心管中；步骤7：用氮吹仪吹干；再加入125μL复溶液，涡旋5分钟；高速离心5分钟后取上清液100μL供色谱分析进样分析；步骤8：将处理好的标准品和血清/血浆样品各100μL注入96孔进样板中，覆上铝箔封膜，启用应用软件，建立样品列表，放入高效液相色谱
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串联质谱仪进行检测，并记录质谱图与检测样品中C3异构体峰面积与相应内标峰面积；步骤9：打开MultiQuantTM或Quantification软件，点击工具栏中的Creates a new Results Table，选择相应数据进行结果分析。以标准品浓度为横坐标，以标准品峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，制作标准曲线，将样品与内标的...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐蓓，蒋文强，俸家富，
申请(专利权)人：绵阳市中心医院，
类型：发明
国别省市：