一种鉴别当归及人参健脾丸中是否混有欧当归的特异性引物、探针和方法技术

本发明专利技术属于中药鉴别技术领域，尤其涉及一种鉴别当归及人参健脾丸中是否混有欧当归的特异性引物、探针和方法。本发明专利技术所述特异性引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为5'

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别当归及人参健脾丸中是否混有欧当归的特异性引物、探针和方法


[0001]本专利技术属于重要鉴别方法
，尤其涉及一种鉴别当归及人参健脾丸中是否混有欧当归的特异性引物、探针和方法。

技术介绍

[0002]人参健脾丸包括大蜜丸、小蜜丸和水蜜丸3种规格，处方组成一致，均由人参、白术、茯苓、当归等十一味药组成，具有健脾益气、和胃止泻的功效。处方中当归为伞形科植物当归Angelica sinensis的干燥根，具有补血活血，调经止痛，润肠通便的功效。
[0003]欧当归为伞形科植物欧当归Levisticum officinale的干燥根，具有通经止痛、发汗利尿的功效。两者在植物基原和外观性状上相近，但功效则有显著差异，故不能混用。由于欧当归易于栽培、生长期短、产量大，价格相对便宜，因此在药材市场上存在当归中掺杂混用欧当归的情况，给人民群众的用药安全带来了不确定的风险因素。
[0004]传统中药鉴别主要依靠性状、显微和理化方法，但这些传统技术往往受制于人员专业知识和从业经验，具有一定的局限性。且当归与欧当归外观性状和化学物质基础相近，特别是在加工成饮片，或作为原料药材投入到中成药制剂生产后，给两者的鉴别带来了更大的困难。
[0005]随着DNA分子生物学技术的不断发展和广泛应用，弥补了中药传统鉴别方法的不足。因此，研究出一种能在DNA层面鉴别当归及其制剂中是否混有欧当归的方法具有重要的研究意义和应用意义。

技术实现思路

[0006]为解决上述现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种鉴别当归及其制剂中是否混有欧当归的方法。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]本专利技术在DNA层面鉴别当归和欧当归，应用到中药及其制剂的分子生物学方法主要为DNA条形码和PCR方法。PCR方法包括聚合酶链式反应和实时荧光PCR，聚合酶链式反应(PCR)是2020年版《中国药典》鉴别药材及其伪品常用分子生物学方法，实时荧光PCR方法较聚合酶链式反应法有更高特异性、灵敏度、稳定性好，不受外界环境干扰，从物种DNA层面进行鉴别，准确度更高；无需大型试验仪器，成本低，更是首次应用到当归及欧当归的鉴别中，是未来中药鉴别发展的方向。
[0009]一种鉴别当归及人参健脾丸中是否混有欧当归的特异性引物，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为5
’‑
CATCCCGTTAGTGGGTAGC
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3'，所述下游引物的核苷酸序列为5'
‑
CCTAGTGGCTTCGGGCG
‑
3'。
[0010]一种鉴别当归及人参健脾丸中是否混有欧当归的探针，所述探针5'端标记荧光素基团FAM，3
’
端标记淬灭基团BHQ1，所述探针的核苷酸序列为FAM
‑
TAGCGGCGTCATTCCAAAATACAAC
‑
BHQ1'。
[0011]一种鉴别当归及人参健脾丸中是否混有欧当归的方法，所述方法利用所述的特异性引物和所述的探针进行当归和欧当归的鉴别，所述方法包括：
[0012]结合所述的特异性引物和所述的探针进行实时荧光PCR反应，检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有欧当归；
[0013]结合所述的特异性引物和所述的探针进行实时荧光PCR反应，检测或辅助检测待测样品是否为或候选为欧当归。
[0014]所述方法的主要步骤包括：
[0015](1)提取待测样品的总DNA；
[0016](2)以提取的DNA为模板，配制PCR反应体系，所述PCR反应体系中包括权利要求1所述的上游引物、下游引物和权利要求2所述的探针，设置反应条件，将PCR反应体系置于荧光定量PCR仪中进行反应；
[0017](3)根据反应结果进行特异性鉴别。
[0018]所述PCR反应体系为：总体积为20μl，分别加入荧光PCR反应混合液(2
×
)10μl，权利要求2所述的探针(2μmol/L)1μl，权利要求1所述的上下游引物(5μmol/L)各1μL，模板DNA溶液0.5μl，灭菌超纯水6.5μl。
[0019]所述PCR反应条件为：将反应体系置于荧光定量PCR仪中进行反应，设定如下参数：阶段1：95℃，3分钟；阶段2：95℃，10秒，65℃，32秒，35个循环。
[0020]步骤(3)所述根据反应结果进行特异性鉴别，以是否有荧光对数增长为判定依据；
[0021]人参健脾丸欧当归阳性样品：按处方量及工艺用同等比例的欧当归药味代替当归药味；
[0022]结果判定包括：
[0023](1)无荧光对数增长，或有荧光对数增长但相应的CT值＞30.0，视为未检出欧当归；
[0024](2)有荧光对数增长，且相应的CT值＜30.0，视为检出欧当归。
[0025]有益效果
[0026]本专利技术公开了一种鉴别当归及人参健脾丸中是否混有欧当归的特异性引物、探针和方法，通过研究比对发现当归和欧当归通过DNA条形码可以将两者分开，因此在DNA条形码研究的基础上，开发实时荧光PCR方法。通过软件分析，寻找当归和欧当归差异性SNP位点，设计欧当归特异性引物和探针，引物和探针是针对欧当归，在试验过程中欧当归有S型荧光扩增曲线，当归则无S型荧光扩增曲线，因此可以根据是否产生S型荧光扩增曲线作为判定当归和人参健脾丸中是否混有欧当归的依据。
附图说明
[0027]图1：引物和探针当归的特异性结果图；
[0028]图2：引物和探针欧当归的特异性结果图；
[0029]图3：引物和探针空白对照的特异性结果图；
[0030]图4：编号ODG
‑
1引物和探针起始位置；
[0031]图5：人参健脾丸标准样品专属性试验结果图；
[0032]图6：人参健脾丸缺当归阴性样品专属性试验结果图；
[0033]图7：当归专属性试验结果图；
[0034]图8：欧当归专属性试验结果图；
[0035]图9：人参健脾丸欧当归阳性样品专属性试验结果图；
[0036]图10：精密度荧光扩增曲线图；
[0037]图11：重复性荧光扩增曲线图。
具体实施方式
[0038]以下，将详细地描述本专利技术。在进行描述之前，应当理解的是，在本说明书和所附的权利要求书中使用的术语不应解释为限制于一般含义和字典含义，而应当在允许专利技术人适当定义术语以进行最佳解释的原则的基础上，根据与本专利技术的技术方面相应的含义和概念进行解释。因此，这里提出的描述仅仅是出于举例说明目的的优选实例，并非意图限制本专利技术的范围，从而应当理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围的情况下，可以由其获得其他等价方式或改进方式。
[0039]以下实施例仅是作为本专利技术的实施方案的例子列举，并不对本专利技术构成任何限制，本领域技术人员可以理解在不偏离本专利技术的实质和构思的范本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别当归及人参健脾丸中是否混有欧当归的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为5'
‑
CATCCCGTTAGTGGGTAGC
‑
3'，所述下游引物的核苷酸序列为5'
‑
CCTAGTGGCTTCGGGCG
‑
3'。2.一种鉴别当归及人参健脾丸中是否混有欧当归的探针，其特征在于，所述探针5'端标记荧光素基团FAM，3'端标记淬灭基团BHQ1，所述探针的核苷酸序列为FAM
‑
TAGCGGCGTCATTCCAAAATACAAC
‑
BHQ1'。3.一种鉴别当归及人参健脾丸中是否混有欧当归的方法，其特征在于，所述方法利用权利要求1所述的特异性引物和权利要求2所述的探针进行当归和欧当归的鉴别。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括：结合权利要求1所述的特异性引物和权利要求2所述的探针进行实时荧光PCR反应，检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有欧当归；结合权利要求1所述的特异性引物和权利要求2所述的探针进行实时荧光PCR反应，检测或辅助检测待测样品是否为或候选为欧当归。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：栾永福，林永强，解盈盈，汪冰，周广涛，周倩倩，穆向荣，
申请(专利权)人：山东省食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：