一种基于CRISPR/Cas12和LAMP的温和镰孢菌可视化检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR/Cas12和LAMP的温和镰孢菌可视化检测方法，通过优化酶切反应条件提高检测速度，并结合LAMP与CRISPR/Cas以提高特异性和灵敏度，基于AuNP使检测结果可视化，且更为简便快速，特异性更强：利用多条引物扩增目的基因组的特异区域，确保扩增的准确性，检测限较低：含有目的基因的质粒检测限为102copies/μL、目标菌的检测限为10

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR/Cas12和LAMP的温和镰孢菌可视化检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，特别是一种基于CRISPR/Cas12和LAMP的温和镰孢菌可视化检测方法。

技术介绍

[0002]温和镰孢菌(Fusarium temperatum)是一种常见的植物致病真菌，可侵染幼苗和秸秆，从而引发玉米茎基腐病。这种疾病的爆发会导致玉米产量的大幅下降，而玉米做为仅次于小麦的全球人类和动物膳食中第二重要的谷类作物，其产量的下降会造成巨大的经济损失和粮食危机。除此之外，F.temperatum还会产生有毒的次级代谢物，称为霉菌毒素，例如白僵菌素、念珠菌素、伏马菌素B1、镰孢菌素和镰刀菌酸等。这些毒素的产生会损害玉米质量并严重威胁食品和动物饲料的安全。因此，对温和镰孢菌的早期准确检测在农业、畜牧业和食品行业中具有重要意义。
[0003]温和镰孢菌可通过传统的培养方法或根据其表型特征结合特定基因的序列分析进行鉴定，但这些方法复杂、耗时耗力，并且需要具有丰富的分类学知识。PCR法耗时较长、需要具备昂贵的仪器设备和训练有素的实验人员等，这些因素限制了它在农业、食品和饲料生产中现场检测的应用。而环介导等温扩增(Loop
‑
mediated isothermal amplification，LAMP)是一种在等温条件下扩增DNA的方法，该技术无需精密的热循环仪，在简单的加热设备中即可进行反应，具有较高的特异性和灵敏度，已被应用于多种病毒和病原菌的检测中。
[0004]成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)与CRISPR associated(Cas)蛋白组成CRISPR/Cas系统，已被开发作为一种检测技术，可特异性识别靶序列并具有催化放大信号的功能。CRISPR/Cas相关检测方法均具有高灵敏度、高特异性的特点。金纳米颗粒因其独特的尺寸、组成、光学特性和易于功能化而被广泛应用于生物传感器中，其光学性质取决于粒子大小和粒子间距离，DNA功能化的金纳米颗粒均匀分散在溶液中呈红色，经互补DNA链交联聚集后则会变为紫色，基于这一颜色变化可以对靶标DNA进行可视化检测。
[0005]因此，亟待开发一种基于CRISPR/Cas12和LAMP的玉米温和镰孢菌可视化检测方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是要解决现有技术中存在的耗时长、操作复杂、仪器设备要求高等问题，提供一种基于CRISPR/Cas12和LAMP的温和镰孢菌可视化检测方法。
[0007]为达到上述目的，本专利技术是按照以下技术方案实施的：
[0008]一种基于CRISPR/Cas12和LAMP的温和镰孢菌可视化检测方法，包括以下步骤：
[0009]S1、使用真菌DNA提取试剂盒提取温和镰孢菌DNA；
[0010]S2、将提取的温和镰孢菌DNA作为样品进行LAMP反应，并通过实时荧光分析仪实时
观测反应的荧光曲线情况；
[0011]S3、将reporter DNA作为探针，LAMP扩增产物作为激活剂进行酶切反应，并通过实时荧光分析仪实时观测反应的荧光曲线情况；
[0012]S4、将linker DNA作为探针进行酶切反应，反应结束后，按AuNP
‑
DNA与linker DNA浓度比1/50向酶切产物中加入预混合的AuNP
‑
DNA1和AuNP
‑
DNA2，再加入5M NaCl溶液使其最终浓度达到750mM，进行显色反应，5min内观察颜色变化；
[0013]S5、通过实时荧光分析仪实时观测荧光曲线情况，若LAMP反应和酶切反应的实时荧光曲线出现荧光值呈指数增加的趋势，显色反应结果仍为红色或粉红色，说明发生了扩增或Cas12a被激活，样品可被判定为阳性；若LAMP反应和酶切反应的实时荧光曲线未出现荧光值呈指数增加的趋势，显色反应结果变为紫色，说明没有发生扩增或Cas12a未被激活，样品可被判定为阴性。
[0014]进一步地，所述步骤S2中LAMP具体包括：
[0015]25μL LAMP反应体系的配制：1μL步骤S1提取的温和镰孢菌DNA；12.5μL LAMP试剂盒中的2
×
Master Mix；2.5μL引物混合物，引物混合物包括浓度为16μM的FIP/BIP，浓度为4μM的LF/LB和浓度为2μM的F3/B3；8.5μL DEPC水；0.5μL SYBR Green I；混匀后在实时荧光PCR仪中65℃反应。
[0016]进一步地，所述步骤S3中的酶切反应具体包括：
[0017]25μL酶切反应体系的配制：20μL复合物，复合物包括浓度比均为1：1.25的Cas12a和gRNA，1.25
×
NEBufffer r2.1，DEPC水补齐20μL后于37℃水浴中孵育10min；而后加入2.5μL浓度为5μM的linker DNA/reporter DNA；2.5μL的LAMP扩增产物；混匀后，34
‑
43℃反应。
[0018]进一步地，所述步骤S4中AuNP
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DNA的制备过程为：
[0019]三(2
‑
羧乙基)膦与硫醇化DNA1/2按浓度比100：1混匀后于室温反应30min；将还原后的硫醇化DNA1/2与AuNP溶液按浓度比300：1混匀后反应24h，分批缓慢加入0.2M、pH为7.4的磷酸盐缓冲液(含2M NaCl)，使NaCl浓度分别达到10mM、50mM、100mM、200mM，过夜；12000rpm，离心20min，弃上清，沉淀用10mM、pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，12000rpm，离心20min，重复上述步骤两次，共洗涤三次以除去多余的硫醇化DNA1/2，最终将沉淀用10mM、pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，得到AuNP
‑
DNA。
[0020]优选地，在25μL酶切反应体系中，所述Cas12a浓度为75nM，gRNA浓度为93.75nM。
[0021]优选地，所述酶切反应的反应温度为37℃。
[0022]与现有技术相比，本专利技术基于CRISPR/Cas12和LAMP对玉米温和镰孢菌进行可视化检测。通过优化酶切反应条件提高检测速度，并结合LAMP与CRISPR/Cas以提高特异性和灵敏度，基于AuNP使检测结果可视化，且更为简便快速，特异性更强：利用多条引物扩增目的基因组的特异区域，确保扩增的准确性，检测限较低：含有目的基因序列的质粒的检测限为102copies/μL、目标菌的检测限为10
‑8ng/μL，且具有可视化的特点，解决了传统检测方法复杂、耗时长、仪器设备要求高等问题，在农作物病原菌现场检测应用中具有巨大潜力。
附图说明
[0023]图1为实施例1中最适反应温度优化图；NTC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas12和LAMP的温和镰孢菌可视化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、使用真菌DNA提取试剂盒提取温和镰孢菌DNA；S2、将提取的温和镰孢菌DNA作为样品进行LAMP反应，并通过实时荧光分析仪实时观测反应的荧光曲线情况；S3、将reporter DNA作为探针，LAMP扩增产物作为激活剂进行酶切反应，并通过实时荧光分析仪实时观测反应的荧光曲线情况；S4、将linker DNA作为探针进行酶切反应，反应结束后，按DNA修饰的纳米金即AuNP
‑
DNA与linker DNA浓度比1/50向酶切产物中加入预混合的AuNP
‑
DNA1和AuNP
‑
DNA2，再加入5M NaCl溶液使其最终浓度达到750mM，进行显色反应，5min内观察颜色变化；S5、通过实时荧光分析仪实时观测荧光曲线情况，若LAMP反应和酶切反应的实时荧光曲线出现荧光值呈指数增加的趋势，显色反应结果仍为红色或粉红色，说明发生了扩增或Cas12a被激活，样品被判定为阳性；若LAMP反应和酶切反应的实时荧光曲线未出现荧光值呈指数增加的趋势，显色反应结果变为紫色，说明没有发生扩增或Cas12a未被激活，样品被判定为阴性。2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12和LAMP的温和镰孢菌可视化检测方法，其特征在于，所述步骤S2中LAMP具体包括：25μL LAMP反应体系的配制：1μL步骤S1提取的温和镰孢菌DNA；12.5μL LAMP试剂盒中的2
×
Master Mix；2.5μL引物混合物，引物混合物包括浓度为16μM的FIP/BIP，浓度为4μM的LF/LB和浓度为2μM的F3/B3；8.5μL DEPC水；0.5μL SYBR Green I；混匀后在实时荧光PCR仪中65℃反应。3.根据权利要求1所述的基于CR...

【专利技术属性】
技术研发人员：王迪，李迎春，胡青织，张雅琴，郭航宇，王佳思，逯家辉，杨家奇，黄诗琪，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：