一种结合GPC3融合蛋白的制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种结合GPC3融合蛋白的制备方法及应用。本发明专利技术提供的融合蛋白包含抗GPC3抗体和VEGF受体的胞外段。本发明专利技术提供的结合GPC3融合蛋白能够在靶向肿瘤特异性表达蛋白GPC3的同时，通过VEGF受体胞外段对VEGF的捕获阻断肿瘤的血管新生，达到肿瘤预防和治疗的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种结合GPC3融合蛋白的制备方法及应用
本专利技术属于医药
，具体涉及一种结合GPC3融合蛋白的制备方法及应用。
技术介绍
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican3，GPC3，SEQIDNO：11)是细胞膜表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖。GPC3核心蛋白由相对分子质量为40KD的N-末端蛋白和30KD的膜结合的C-末端蛋白组成。C-末端通过糖基磷脂酰肌醇锚蛋白(glycosyl-phosphatidylinositolanchor，GPI)锚定在细胞表面，可结合肝素结合型蛋白，如生长因子。GPC3基因在不同的组织中表达差异很大，其在肝细胞癌组织中高表达，而在非肿瘤肝组织、肝细胞腺瘤、胆管癌、肝内胆管细胞癌、胆囊癌和肝脏转移性肿瘤中低表达甚至不表达。GPC3中Arg358和Ser359之间的酶切位点酶切后产生相对分子质量40KD的N-末端片段和30KD的C-末端片段。有研究证明，C-GPC3诱导产生的单克隆抗体会产生抗体依赖性的细胞毒性(antibody-dependentcellularcytotoxicity，ADCC)。US9790267B2、US20100248359A1、WO2004022739、US9409994B2、CN108164600A、CN107982538A和CN109988240A等专利中明确了抗GPC3抗体或者结合GPC3的蛋白片段，这些抗体或者结合片段通过重组表达人源化的抗体或者嵌合抗原受体T细胞等形式用于癌症尤其是肝癌的治疗。中国专利201911053957.1中公开了一种抗人GPC3单克隆抗体，是以人源GPC3为靶点，基于噬菌体展示技术，开发的特异性、高亲和力的纳米抗体，是肿瘤免疫治疗的潜在药物。血管新生支撑着肿瘤的发生发展过程，它在肿瘤的扩增、侵袭、转移等方面发挥着巨大的促进作用。在发挥血管新生作用中，VEGF(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)及其受体(VEGFR)信号通路占据着主导地位。VEGF的靶向药物可以与特定的内皮细胞受体结合，对肿瘤细胞的生长产生抑制作用，从而达到治疗目的。药物对VEGF产生抑制，肿瘤细胞无法顺利得到血液供应，其生长和增殖均会受到影响。专利WO1998045332、WO2003075840、WO2016060297、US20120003641所提供的针对VEGF或其受体的治疗性抗体均对肿瘤显示出良好的疗效。中国专利201710444942.2中公开了一种抗人VEGF(VEGFA)的抗体，该抗体的重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3中的一种或多种，抗体与VEGF结合，抑制或阻断VEGF与VEGFR的结合，从而影响其后续的信号通路以及相应的生物学功能，在抗肿瘤中有很好的应用前景。现有技术中，未有将GPC3和VEGF二者相关蛋白结合的技术方案的公开。针对上述技术空白，本专利技术提供的融合蛋白，在靶向肿瘤细胞后通过抗体依赖的细胞毒性作用和补体依赖的细胞毒性(complementdependentcytotoxicity，CDC)效应杀伤肿瘤，同时阻断VEGF和其受体的信号通路，为肿瘤的治疗提供了一种新的手段。
技术实现思路
本专利技术提供了一种结合GPC3融合蛋白的制备方法及应用。本专利技术提供的结合GPC3融合蛋白在靶向肿瘤特异性表达蛋白GPC3的同时，通过VEGF受体胞外段对VEGF的捕获阻断肿瘤的血管新生，达到肿瘤预防和治疗的目的。一方面，本专利技术提供了一种结合GPC3的融合蛋白。具体地，所述的融合蛋白包含抗GPC3抗体和VEGF受体的胞外段。具体地，所述的抗GPC3抗体序列包含轻链可变区和重链可变区。优选地，所述的轻链可变区为SEQIDNO：1。优选地，所述的重链可变区为SEQIDNO：2。具体地，所述的抗GPC3抗体序列还包含Fc片段。进一步具体地，所述的抗GPC3抗体序列的Fc片段选自人IgG1、IgG2、IgG4的Fc序列及其突变体；优选为人IgG1的Fc序列；进一步优选为SEQIDNO：3所示的氨基酸序列。具体地，所述的VEGF受体胞外段选自人VEGF受体胞外段序列。进一步具体地，所述的VEGF受体胞外段为VEGF受体胞外段全长序列或者截短形式的序列或VEGF受体胞外段的突变体；优选为SEQIDNO：4所示的氨基酸序列。具体地，所述的VEGF受体胞外段与抗GPC3抗体的连接方式可以为直接连接或接头连接。优选地，所述的VEGF受体胞外段通过与抗GPC3抗体重链的N端或者C端连接后形成融合蛋白。其他优选地，所述VEGF受体胞外段通过与抗GPC3抗体轻链的N端或者C端连接后形成融合蛋白。进一步具体地，所述的接头连接方式中，接头的氨基酸序列独立或组合地选自以下氨基酸序列：(GxSy)n、KESGSVSSEQLAQFRSLD、EGKSSGSGSESKST、GSAGSAAGSGEF、EPSGPISTINSPPSKESHKSP、GTVAAPSVFIFPPSD、GGGGIAPSMVGGGGS、GGGGKVEGAGGGGGS、GGGGSMKSHDGGGGS、GGGGNLITIVGGGGS、GGGGVVPSLPGGGGS、GGEKSIPGGGGS、RPLSYRPPFPFGFPSVRP、YPRSIYIRRRHPSPSLTT、TPSHLSHILPSFGLPTFN、RPVSPFTFPRLSNSWLPA、SPAAHFPRSIPRPGPIRT、APGPSAPSHRSLPSRAFG、PRNSIHFLHPLLVAPLGA、MPSLSGVLQVRYLSPPDL、SPQYPSPLTLTLPPHPSL、NPSLNPPSYLHRAPSRIS、LPWRTSLLPSLPLRRRP、PPLFAKGPVGLLSRSFPP、VPPAPVVSLRSAHARPPY、PNVAHVLPLLTVPWDNLR，其中x为0、1、2、3、4、5，y为0、1、2、3、4、5，n为0、1、2、3、4、5。另一方面，本专利技术提供了编码上述任一技术方案得到的融合蛋白的核酸分子。再一方面，本专利技术提供了一种表达载体，所述的表达载体包含前述任一技术方案得到的融合蛋白的核酸分子。又一方面，本专利技术提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含前述表达载体。又一方面，本专利技术还提供了前述融合蛋白、核酸分子、表达载体或宿主细胞在制备用于肿瘤的预防或者治疗的药物中的用途。具体地，所述的肿瘤包括但不限于肝癌、肺癌，结肠癌，前列腺癌，胰腺癌、淋巴瘤及其转移癌。又一方面，本专利技术还提供了一种药物组合物。具体地，所述的药物组合物包括前述融合蛋白、核酸分子、表达载体或宿主细胞中的一种或多种。具体地，所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体。具体地，所述的药学上可接受的载体包括但不限于：稀释剂、赋形剂、填充剂、润湿剂、崩解剂、矫味剂和粘合剂。附图说明图1为PHP1008融合蛋白纯化后的SEC-HPLC检测结果。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种结合GPC3的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包含抗GPC3抗体和VEGF受体的胞外段。/n

【技术特征摘要】
1.一种结合GPC3的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包含抗GPC3抗体和VEGF受体的胞外段。


2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的抗GPC3抗体序列的Fc选自人IgG1、IgG2、IgG4的Fc序列及其突变体；优选自人IgG1的Fc序列，进一步优选为SEQIDNO：3。


3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的VEGF受体胞外段选自人VEGF受体胞外段序列；所述的VEGF受体胞外段为VEGF受体胞外段全长序列或者截短形式的序列或VEGF受体胞外段的突变体，优选为SEQIDNO：4。


4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的VEGF受体胞外段通过直接连接或接头连接至所述的抗GPC3抗体的重链或轻链形成融合蛋白。


5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述的VEGF受体胞外段通过与抗GPC3抗体重链的N端或者C端连接后形成融合蛋白，或者所述的VEGF受体胞外段通过与抗GPC3抗体轻链的N端或者C端连接后形成融合蛋白。


6.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述的抗GPC3抗体与VEGF受体胞外段通过接头进行连接，所述接头独立或组合地选自：(GxSy)n、KESGSVSSEQLAQFRSLD、EGKSSGSGSESKST、GSAGSAAGSGEF、EPSGPISTINSPPSKESHKSP、GTVAAPSVFIFPPSD、GGGGIAPSMVGGGGS、GGGGKVEGAGGGGGS、GGGGSMKSHDGGGGS、GGGGNLITIV...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鹏，马琳，郭树华，
申请(专利权)人：苏州普乐康医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32