用于对HBV cccDNA进行甲基化修饰的融合蛋白及其用途制造技术

本发明专利技术设计了一种用于对HBV cccDNA进行甲基化修饰的融合蛋白及其相应的核酸序列和表达载体，从而实现了针对HBV cccDNA的靶向甲基化。所述HBV cccDNA甲基化修饰策略可用于制备抑制HBV的药物，继而为乙型肝炎的治疗提供了一种全新的策略，具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
用于对HBVcccDNA进行甲基化修饰的融合蛋白及其用途
本专利技术涉及抗病毒药物
，具体地，涉及一种用于对HBVcccDNA进行甲基化修饰的融合蛋白及其用途。
技术介绍
乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝DNA病毒科，是引发病毒性乙型肝炎的病原体。全球约1/3的人曾感染过HBV，慢性HBV感染者约有3-4亿人，其中25％-40％人死于HBV感染相关疾病。我国属于HBV感染的高流行区，一般人群的乙肝病毒感染标志，乙肝病毒表面抗原(HBsAg)阳性率接近10％。对现有病毒性乙型肝炎患者及HBsAg携带者的防治工作，在今后几十年里仍会是一项艰巨的任务。HBV是一种逆转录病毒，其基因组是由两条螺旋的DNA链围成的一个环状结构，大小约为3.2KB，是一种相当小的病毒。其基因组共有四个开放阅读框(ORF)，编码以下一些蛋白：Core蛋白和pre-core蛋白、Pol蛋白、X蛋白、以及S蛋白。两条螺旋的DNA链，其中一条较长负链已经形成完整的环状，另一条长度较短的正链呈半环状。一旦感染肝细胞，病毒DNA就会进入细胞核，在核中，该半环状的DNA链以负链为模板，在乙肝病毒DNA聚合酶的作用下延伸，最终形成完整的环状。乙肝病毒基因组也就形成了一个完整的环状双链DNA，即共价闭合环状DNA(cccDNA)。cccDNA可以看做是病毒复制的原始模板，既能转录产生3.5KB的前基因组mRNA，又能转录病毒mRNA并翻译产生包括HBsAg在内的四种病毒蛋白。病毒基因以其中的一条cccDNA为模板转录形成前基因组mRNA之后，前基因组DNA逆转录形成负链DNA，复制出正链，最后再装配至一起形成新的双链HBVDNA，其中一部分双链DNA会在核中重新形成cccDNA。每个细胞核中大约15-20个拷贝的cccDNA可能会在易错的病毒复制多聚酶的作用下发生病毒变异，从而产生抗药性。目前，治疗乙型肝炎的药物主要包括核苷(酸)类似物和干扰素等，其中以核苷(酸)类似物临床应用最广泛。核苷(酸)类似物可以阻断病毒RNA和新的病毒DNA的产生，但是对于已经存在的病毒cccDNA却没有作用。随着HBV耐药突变株的不断出现，使得现有的抗HBV药物难以达到理想的治疗效果。此外，HBVcccDNA还可能是病毒产生抗药性的关键原因，因此，即使是部分失活HBVcccDNA仍具有重要的治疗价值。在此基础上，特异性靶向HBVcccDNA的治疗手段引起了人们的广泛关注。首当其冲的即为基因编辑技术。2010年，Engineeredzincfingernucleases(ZFN)被成功应用于HBVcccDNA的敲除，效率大约为26％。2013年，TALEN也被用于突变HBVcccDNA，效率大约为35％，相应地，HBsAg降低了大约20％。此外，规律成簇间隔短回文重复系统(CRISPR-Cas9)是一种具有核酸内切酶活性的复合体，能识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链DNA断裂，在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接，造成移码突变，导致基因敲除。这一技术由于能快速、简便、高效地靶向基因组任何基因，从而引起了广泛的关注。目前已有文献将CRISPR-Cas9技术应用于敲除HBVcccDNA而治疗乙型肝炎。但是，上述基因编辑技术潜在的脱靶效应以及缺乏合适的体内递呈载体限制了其在临床上的使用，通过基因编辑技术靶向cccDNA的治疗手段仍有待进一步开发与优化。在此基础上，学界开始尝试对HBVcccDNA进行表观遗传学修饰。表观遗传学又称“表遗传学”、“外遗传学”以及“后遗传学”，旨在研究在没有DNA序列改变的情况时，基因功能的可逆的、可遗传的改变。这些改变包括DNA的修饰(如甲基化修饰)、组蛋白的各种修饰等。其中DNA甲基化是其中重要的修饰方式之一。HBV基因组包含3个主要的CpG岛，岛1在55～281bp处，含有表面抗原的ATG起始密码子；岛2在1228～1663bp处，含有增强子1和X基因启动子；岛3在2295～2446bp处，含有聚合酶ATG起始密码子。CpG岛2含CG序列较多，且多为基因调控序列，因此天然可作为人工甲基化干预的靶序列。已有研究表明，CpG岛2的甲基化可显著降低cccDNA的转录水平，提示改变HBVcccDNA的甲基化状态可作为一种潜在的实现功能性治愈的手段。然而，如何将HBVcccDNA甲基化作为一种有效的乙型肝炎治疗手段仍是难以解决的技术问题。此外，DNA甲基化转移酶(DNMT)自身缺乏有效的选择性和靶向性，因此难以直接靶向HBVcccDNA进行选择性的甲基化。
技术实现思路
本专利技术通过设计一种用于对HBVcccDNA进行甲基化修饰的融合蛋白及其相应的核酸序列和表达载体而实现了针对HBVcccDNA的靶向甲基化，从而解决了上述技术问题。所述HBVcccDNA甲基化修饰策略可用于制备抑制HBV的药物，继而为乙型肝炎的治疗提供了一种全新的策略，具有广泛的应用前景。在第一方面中，本专利技术提供了一种用于对HBVcccDNA进行甲基化修饰的融合蛋白，所述融合蛋白包含靶向cccDNA的肽段序列以及DNA甲基化转移酶(DNMT)序列。在一个优选实施方式中，所述靶向cccDNA的肽段序列以及DNA甲基化转移酶序列通过连接子进行连接。优选地，所述连接子的氨基酸序列可为LEGGGGSGGGGS。在一个优选实施方式中，所述靶向cccDNA的肽段序列为HBc144。所述HBc144的氨基酸序列为：在第二方面中，本专利技术提供了编码本专利技术所述融合蛋白的核酸序列。在一个优选实施方式中，所述核酸序列中对应于连接子的核酸序列可为：5’-CTGGAGGGTGGCGGTGGAAGCGGTGGTGGCGGAAGC-3’。在一个优选实施方式中，所述靶向cccDNA的肽段序列为HBc144，且所述HBc144的核酸序列为：5’-CCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAG-3’。在第三方面中，本专利技术提供了一种用于对HBVcccDNA进行甲基化修饰的融合蛋白的构建方法，其包括去除HBV核心蛋白HBc的结构区，保留HBc的CTD非结构区作为靶向分子，并将其记为HBc144；以及合成DNMT-HBc144编码基因序列，并将其克隆至表达载体，由此构建表达所述融合蛋白的表达载体。在第四方面中，本专利技术提供了一种表达载体，其包含克隆至其中的DNMT-HBc144编码基因序列。在一个优选实施方式中，所述表达载体选自腺病毒载体、腺相关病毒载体和慢病毒载体。优选地，所述表达载体选自腺病毒载体。在第五方面中，本专利技术提供了本专利技术所述的融合蛋白、核酸序列或表达载体在制备用于对HBVcccDNA进行甲基化修饰的药物或试剂盒中的用途。在第六方面中，本专利技术提供了本专利技术所述的融合蛋白、核酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于对HBV cccDNA进行甲基化修饰的融合蛋白，所述融合蛋白包含靶向cccDNA的肽段序列以及DNA甲基化转移酶(DNMT)序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于对HBVcccDNA进行甲基化修饰的融合蛋白，所述融合蛋白包含靶向cccDNA的肽段序列以及DNA甲基化转移酶(DNMT)序列。


2.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述靶向cccDNA的肽段序列以及DNA甲基化转移酶序列通过连接子进行连接，所述连接子的氨基酸序列为LEGGGGSGGGGS。


3.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述靶向cccDNA的肽段序列为HBc144。


4.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述HBc144的氨基酸序列为：
PETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC。


5.编码权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白的核酸序列。


6.权利要求5所述的核酸序列，其中连接子的核酸序列为：
5′-CTGGAGGGTGGCGGTGGAAGCGGTGGTGGCGGAAGC-3′。


7.权利要求5所述的核酸序列，其中所述HBc144的核酸序列为：
5′-CCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAG-3′。

【专利技术属性】
技术研发人员：瞿镕，
申请(专利权)人：中以海德人工智能药物研发股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44