一种嵌合抗原受体及应用制造技术

提供一种嵌合抗原受体，包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域组成的共刺激信号结构域，该共刺激信号结构域包括编码反向dectin‑1的氨基酸全长或片段，可治疗多种实体肿瘤和血液恶性肿瘤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种嵌合抗原受体及应用优先权申请本申请要求2020年2月13提交的中国专利技术专利申请【CN2020100907495】、名称为“一种嵌合抗原受体的共刺激信号结构域及其应用”的优先权，该优先权专利技术专利申请以引用方式全文并入。
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种嵌合抗原受体及应用。
技术介绍
嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor，CAR)T细胞免疫疗法，作为一种非常有前景的肿瘤治疗策略，经历了一系列演化过程。第一代CAR介导的T细胞激活是通过CD3δ或FceRIg上的酪氨酸激活基序完成的。但第一代CAR改造T细胞的抗肿瘤活性在体内受到了限制，因T细胞增殖减少最终导致T细胞的凋亡。第二代CAR在胞内增加了一个新的共刺激信号，例如4-1BB或CD28。第二代CAR与第一代CAR相比，抗原特异性不变，T细胞增殖、细胞因子分泌增加，抗细胞凋亡蛋白分泌增加，细胞死亡延迟。然而，现有的CAR-T细胞免疫疗法目前仅在治疗血液恶性肿瘤方面取得了显著进展，而在治疗实体瘤领域的成功有限。CAR-T细胞免疫疗法在治疗血液恶性肿瘤方面的进展包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)，B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)，多发性骨髓瘤(MM)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。到目前为止，CD19特异性或BCMA特异性CAR-T的临床试验的客观缓解率(ORR)为48％～95％。2017年，美国食品药品监督管理局(USFDA)批准了两种针对B细胞淋巴瘤的CAR-T细胞产品，AxicabtageneCiloleucel(KTE-C19,KitePharma)和Tisagenlecleuce(CTL019,Novartis)。在Axicabtageneciloleucel的1/2期临床试验中，对108名难治性大B细胞淋巴瘤患者进行了为期2年的随访。结果显示，83％的患者达到客观缓解(OR)，58％的患者达到完全缓解(CR)，平均随访期为15.4个月(IQR13.7-17.3)。这表明CAR-T细胞治疗可以维持长期缓解。但在实体瘤治疗中，CAR-T细胞疗法仍然面临许多挑战。例如缺乏适当的肿瘤特异性抗原，肿瘤微环境抑制以及CAR-T细胞定位和持久性不足。另外，持续的抗原暴露会导致CAR-T细胞衰竭，进而损害CAR-T细胞对肿瘤的有效性。因此，需要设计新的CAR来用于实体瘤的治疗。Dectin-1，即CLEC-7A，是C型凝集素受体(CLRs)的一个新的亚组。Dectin-1包括细胞外结构域，跨膜结构域和细胞内结构域。Dectin-1的细胞外部分已被用作靶向真菌的CAR-T细胞的scFv。Dectin-1不仅主要在包括中性粒细胞，单核细胞，树突状细胞和巨噬细胞在内的髓样细胞上表达，而且在人的T细胞和B细胞的某些亚群上也表达。Dectin-1通过激活NK细胞在肿瘤生长和转移中起重要作用。Dectin-1还可以调节各种细胞反应，例如DC成熟，抗原呈递以及细胞因子和趋化因子的产生。此外，理论上，Dectin-1可以直接诱导先天免疫记忆，并影响CD8、CD4、T细胞和B细胞的发育。综上，本专利技术实验团队设计将Dectin-1并入二代CAR结构中作为共刺激信号域，评估其改造的新型二代CAR-T细胞的功能和抗肿瘤活性。以解决上述问题中的至少一个。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种新型的二代CAR结构。一种嵌合抗原受体，包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述嵌合抗原受体的所述跨膜结构域和所述胞内结构域组成共刺激信号结构域，所述共刺激信号结构域包括编码反向dectin-1的氨基酸全长或片段。进一步，所述胞外结构域包括靶向CD19或靶向HER2的单链抗体。进一步，所述嵌合抗原受体还包括依次连接的CD8α铰链区、反向dectin-1跨膜结构域、反向dectin-1胞内信号域和CD3δ胞内信号域。进一步，编码所述反向dectin-1氨基酸的序列如SEQIDNO.3所示。进一步，编码所述反向dectin-1跨膜结构域的氨基酸的序列如SEQIDNO.2所示。进一步，编码所述反向dectin-1胞内信号域的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。包含上述任一项所述的嵌合抗原受体的慢病毒载体。进一步，所述慢病毒载体包括pCLK、psPAX2或pMD2.0G。本专利技术的目的还在于提供一种根据上述新型的二代CAR改造的CAR-T细胞及其应用。一种CAR-T细胞，表达上述嵌合抗原受体。一种抗肿瘤药，含有上述CAR-T细胞和药学上允许添加的辅料和/或助剂。进一步，所述肿瘤包括血液肿瘤和实体肿瘤。进一步，所述肿瘤包括大B细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、髓细胞白血病、淋巴细胞白血病、乳腺癌、胃癌、食管癌或卵巢癌。上述CAR-T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。进一步，所述CAR-T细胞可以刺激效应细胞因子分泌。进一步，所述效应细胞因子包括IFN-γ，TNF-α和IL-6。进一步，所述CAR-T细胞可以刺激细中央记忆型T细胞分泌。进一步，所述肿瘤包括血液肿瘤和实体肿瘤。进一步，所述肿瘤包括大B细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、髓细胞白血病、淋巴细胞白血病、乳腺癌、胃癌、食管癌或卵巢癌。本专利技术的目的还在于提供一种合成上述嵌合抗原受体的方法。上述嵌合抗原受体的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)合成所述反向dectin-1跨膜结构域-反向dectin-1胞内结构域的基因序列或反向dectin-1跨膜结构域-CD3δ胞内信号域的基因序列；(2)根据靶点合成引物，再利用重叠PCR法合成所述嵌合抗原受体基因序列。进一步，所述步骤(2)具体包括：先用引物F1、R1扩增所述胞外结构域和所述CD8α铰链区结合的基因序列，然后再用引物F2、R2扩增所述反向dectin-1跨膜结构域-CD3δ胞内信号域的基因序列，最后以所述胞外结构域和CD8α铰链区结合的基因序列和所述反向dectin-1跨膜结构域-CD3δ胞内信号域的基因序列为模板，以F1、R2为引物，合成所述嵌合抗原受体的基因序列。进一步，所述引物F1如SEQNo.7所示，R1如SEQNo.8所示，F2如SEQNo.9所示，R2如SEQNo.10所示。合成所述反向dectin-1跨膜结构域-反向dectin-1胞内结构域的基因序列的方法一致。有益效果本专利技术提供了一种以反向Dectin-1作为共刺激信号域的新型二代CAR结构以及其制备得到的CAR-T细胞。本专利技术的体内体外实验结果显示，新的CAR设计通过Dectin-1共刺激影响了T细胞功能，增强了多种细胞因子(包括IFN-γ，TNF-α和IL-6)的分泌和裂解能力，降低了衰竭力，增加了细胞扩增和显著的抗肿瘤活性。本专利技术提供的新型CAR-T细胞实验证明对多种实体肿瘤和血液恶性肿瘤有效。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种嵌合抗原受体，包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其特征在于，所述嵌合抗原受体的所述跨膜结构域和所述胞内结构域组成共刺激信号结构域，所述共刺激信号结构域包括编码反向dectin-1的氨基酸全长或片段。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20200213 CN 20201009074951.一种嵌合抗原受体，包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其特征在于，所述嵌合抗原受体的所述跨膜结构域和所述胞内结构域组成共刺激信号结构域，所述共刺激信号结构域包括编码反向dectin-1的氨基酸全长或片段。


2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外结构域包括靶向CD19或靶向HER2的单链抗体。


3.如权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括依次连接的CD8α铰链区、反向dectin-1跨膜结构域、反向dectin-1胞内信号域和CD3ζ胞内信号域。


4.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，编码所述反向dectin-1氨基酸的序列如SEQIDNO.3所示。


5.如权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，编码所述反向dectin-1跨膜结构域的氨基酸的序列如SEQIDNO.2所示。


6.如权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，编码所述反向dectin-1胞内信号域的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


7.包含权利要求1-6任一项所述的嵌合抗原受体的慢病毒载体。


8.如权利要求7所述的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体包括pCLK、psPAX2或pMD2.0G。


9.一种CAR-T细胞，其特征在于，表达权利要求1-6任一项所述的嵌合抗原受体。


10.一种抗肿瘤药，其特征在于，含有权利要求9所述的CAR-T细胞和药学上允许添加的辅料和/或助剂。


11.如权利要求10所述的抗肿瘤药，其特征在于，所述肿瘤包括血液肿瘤和实体肿瘤。


12.如权利要求10所述的抗肿瘤药，其特征在于，所述肿瘤包括大B细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玮，魏于全，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51