新型合理设计的蛋白质组合物制造技术

提供涉及或来自于合理设计的融合蛋白组合物的新组合物和方法，将治疗抗体与IL2突变体结合，可以增强抗肿瘤免疫力或去肿瘤相关免疫抑制，同时通过IL2直接激活效应细胞而不激活T

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型合理设计的蛋白质组合物相关申请的交叉引用本申请要求2018年10月29日递交的申请号为62/752,293，以及2019年2月27日递交的申请号为62/811,116的美国临时专利申请的优先权并要求享有这些申请的权益，这些临时专利申请的完整内容引入本申请当中作为参考。
技术介绍
IL2白细胞介素-2(IL2)是一种细胞因子，在免疫系统的休眠和激活状态中发挥核心作用。在休眠阶段，IL2主要确保CD4+Foxp3+调节T细胞(Tregs)的发育和存活。然而，在免疫应答中，其促进效应T细胞和记忆T细胞以及自然杀伤(NK)细胞的增殖和扩增。它还增强这些细胞的效应功能。IL2由多种细胞(CD8+T细胞、NK和NKT细胞、树突状细胞和肥大细胞)激活后分泌，但它主要来自于CD4+T细胞；并且它可以以自分泌或旁分泌方式作用。三条多肽链参与构成IL2受体，当以不同组合存在时(表1)，以不同亲和力结合IL2。这些受体的生物学重要类型可以通过其对IL2的亲和力进行区分：低亲和力(仅CD25)、中亲和力(βγ)和高亲和力(αβγ)。CD122和普通γ链对于基于IL2结合的信号转导是必要的，然而CD25增加受体亲和力却似乎不影响信号转导。表1基于亚单位组合的IL2受体IL2的不同功能主要是由于不同IL2受体亚单位在不同细胞类型上的不同表达的结果。在休眠的免疫细胞上，CD25主要局限在Tregs，其也表达其它IL2受体亚单位，因此使它们在休眠状态时成为低水平IL2的主要靶点。在效应T细胞上，CD25在近期激活的T细胞上被上调，同时伴有CD122水平的轻微升高，而普通γ链的表达相对不变，导致在扩增阶段对IL2升高的敏感性以及高依赖性。在免疫反应的后期阶段，记忆CD8+T细胞和NK细胞表达非常高水平的CD122和γ链，让它们和Tregs竞争IL2。考虑到IL2作为一种普通的T细胞生长因子的角色，其作为癌症免疫疗法已经用于临床数十年。然而，考虑到受体的表达类型，需要高剂量IL2来充分激活载有中亲和力受体的效应T细胞和NK细胞，以抵消其对载有高亲和力受体的Treg细胞的作用。另一个IL2施用的问题是其在血液中的半衰期小于30分钟，因此需要持续输注或反复注射以维持足够高的滴度以产生治疗效果。高剂量方案引起很多副作用，包括肺水肿(由于肺上皮细胞的CD25表达)、低血压、血管渗漏综合征等。此外，患者Treg细胞扩增对抗肿瘤反应构成持续的威胁。为了规避IL2治疗的这些局限性，化学修饰，例如，PEG化已被用于降低或改变IL2的受体选择性以及延长其半衰期。另一种方法是使用特定抗IL2抗体与IL2形成复合物以达到对CD122表达细胞的优先靶向。但是，这两种方式目前除面临生产挑战外，还面临有限的临床成功。或者，IL2的突变体优先结合CD122或不再结合CD25，允许效应T细胞更好地与Treg细胞竞争IL2。然而，这些分子还是具有与野生型IL2一样的短的半衰期，因此需要重复输注。检查点抗体在正常生理状况下，免疫检查点是为维持自我耐受以及在免疫系统对感染应答时保护组织免受损害而演变来的分子通路。肿瘤通过错误表达免疫检查点蛋白来共同选择这些通路，形成免疫抑制环境并躲避免疫系统。在过去十年，阻断CTLA-4和PD1/PDL1通路的抗体显示逆转肿瘤相关免疫抑制，并证明在临床上是极其成功的。但是，尽管它们具有前景，这些抗体只在一小部分患者中有效，原因目前尚不完全明确。因此，需要更好地了解预测生物标记物和可以与检查点抗体联用的疗法。专利技术概述本专利技术通过使用合理设计的融合蛋白组合物应对上述挑战，该组合物可以增强抗肿瘤免疫力或去抑制肿瘤相关免疫抑制的同时通过IL2直接激活效应细胞，而不激活Treg。本专利技术的融合蛋白包含免疫检查点抗体的部分或全部，以及突变的白细胞介素2(IL2)多肽。本专利技术的融合蛋白可以单独或者与(a)靶向至少另一种免疫抑制通路的抗体；(b)化疗、靶向治疗或放射治疗；(c)阻断免疫抑制通路的另一种机制，例如，核酸适配体或RNAi；或(d)另一种免疫治疗药物，例如，细胞因子、靶向治疗等联合，用于治疗肿瘤。在一方面，本专利技术提供了一种融合蛋白，其结合免疫检查点抗体(下文也称为抗检查点抗体或抗-CP抗体)和对高亲和力受体选择性更低的IL2突变体(或可称为，中亲和力受体选择性突变体，MutIL2)。该融合蛋白由完整的抗-CP抗体和MutIL2组成，在抗-CP抗体的重链的C端连接着MutIL2(图1A)。这种方式可以在重链的C端和MutIL2之间增加一个接头序列。另外，该抗体Fc部分的存在，允许使用Fc新生儿受体通路来延长融合蛋白的半衰期几个数量级。此外，肿瘤靶向抗体的存在将有助于优先递送IL2进入肿瘤并减少全身副作用。在一个特征中，抗CP抗体是抗PDL1抗体。优选地，抗PDL1抗体具有以下一个或多个特征，可以增加融合蛋白的抗肿瘤能力：(a)以Kd<100nM结合PDL1，包括纯化的PDL1蛋白和细胞表面表达的PDL1蛋白；(b)体外阻断PDL1-PD1相互作用；和(c)在激活的PBMC培养基中，解除(de-repress)PDL-1介导的效应T细胞的抑制。在一个实施方案中，抗PDL1抗体是没有、减弱或增强ADCC和/或CDC功能的任何可获得的同种型或Fc区任何已知突变形式的抗体。在一个优选的实施方案中，抗PDL1抗体是IgG1同种型。在一些实施方案中，抗PDL1抗体包含一对重链可变区和轻链可变区，其各自对应的序列基本上由以下序列组成：(a)SEQIDNO:3和SEQIDNO:6；(b)SEQIDNO:9和SEQIDNO:12；或(c)SEQIDNO:15和SEQIDNO:18。在一些实施方案中，抗PDL1抗体进一步包含第二对重链可变区和轻链可变区，和第一对的重链可变区和轻链可变区序列基本相同。在其它实施方案中，抗PDL1抗体包含一对重链和轻链，其各自对应的序列基本上由以下序列组成：(a)SEQIDNO:2和SEQIDNO:5；(b)SEQIDNO:8和SEQIDNO:11；或(c)SEQIDNO:14和SEQIDNO:17。在一个特征中，MutIL2具有以下一个或两个特征，可以增加融合蛋白的抗肿瘤能力：(a)降低激活CTLL2及人和小鼠Treg的能力同时保留激活效应T细胞或NK细胞的能力；和(b)与野生型IL2相比，激活Teff/Treg的相对能力增加至10倍-1000倍以上。在进一步的实施方案中，MutIL2包含氨基酸序列，与选自由以下氨基酸序列所组成的群组中的氨基酸序列基本上相同：SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，包含治疗性蛋白与突变的白细胞介素-2(IL2)相连的多肽。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181029 US 62/752,293;20190227 US 62/811,1161.一种融合蛋白，包含治疗性蛋白与突变的白细胞介素-2(IL2)相连的多肽。


2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中治疗性蛋白是一种治疗性抗体，或一种肿瘤抗原结合多肽。


3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中突变的IL2多肽比野生型IL2对高亲和力受体选择性更低。


4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中融合蛋白包含免疫检查点抗体的部分或全部，和突变的白细胞介素2(IL2)多肽。


5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中免疫检查点抗体的部分或全部包含一对重链和一对轻链，其中突变的IL2多肽与重链的C端相连。


6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中突变的IL2多肽通过接头序列与重链的C端相连。


7.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中融合蛋白包含双特异性设计的抗体类似物，所述双特异性设计的抗体类似物具有与抗体类似物的Fc部分融合的第一条臂和第二条臂，其中第一条臂对应为免疫检查点抗体，第二条臂包含突变的IL2多肽。


8.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中融合蛋白由抗原结合多肽连接突变的IL2多肽组成。


9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中抗原结合多肽和突变的IL2多肽通过接头序列连接。


10.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中抗原结合多肽选自由以下所组成的群组：抗检查点scFv、配体和配体的一部分。


11.根据权利要求10所述的融合蛋白，其中抗检查点scFv是抗PDL1scFv，配体是PD1或CTLA4。


12.根据权利要求1、2、3、4或8任一项所述的融合蛋白，其中突变的IL2多肽相比于野生型IL2具有如下一个或两个特征：(a)激活CTLL2及人和小鼠Treg的能力下降，同时保留激活效应T细胞或NK细胞的能力；和(b)显示显著更高的选择性能力以激活Teff超过Treg。


13.根据权利要求1、2、3、4或8任一项所述的融合蛋白，其中突变的IL2多肽包含氨基酸序列，与选自由以下氨基酸序列组成的群组中基本上相同：SEQIDNO:23,SEQIDNO:25,SEQIDNO:27,SEQIDNO:29,SEQIDNO:31,SEQIDNO:33,SEQIDNO:35,SEQIDNO:37,SEQIDNO:39,SEQIDNO:41,SEQIDNO:43,SEQIDNO:45,SEQIDNO:47,SEQIDNO:49,SEQIDNO:51,SEQIDNO:53,SEQIDNO:55,SEQIDNO:57及其组合。


14.根据权利要求4、5或7任一项所述的融合蛋白，其中免疫检查点抗体是抗PDL1抗体。


15.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中抗PDL1抗体具有如下一个或多个特征：(a)以Kd<100nM结合PDL1，包括纯化的PDL1蛋白和细胞表面表达的PDL1蛋白；(b)体外阻断PDL1-PD1相互作用；和/或(c)在激活的PBMC培养基中，去解除PDL1介导的效应T细胞抑制。


16.根据权利要求4、5或7任一项所述的融合蛋白，其中免疫检查点抗体是调节或增强ADCC和/或CDC功能的任何可获得同种型或Fc区任何已知突变形式的抗体。


17.根据权利要求4、5或7任一项所述的融合蛋白，其中免疫检查点抗体是IgG1同种型抗体。


18.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中免疫检查点抗体进一步包含第二对与第一对基本上相同的重链可变区和轻链可变区。


19.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中抗PDL1抗体包含一对重链可变区和轻链可变区，其各自对应的序列基本上由以下成对序列组成：(a)SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：李嘉强，希亚姆·乌尼拉曼，汉娜·巴德，刘艾伦，
申请(专利权)人：北京强新生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11