具有IL-7活性的双功能分子制造技术

提供具有靶向肿瘤抗原的抗原结合单元和融合到Fc片段的IL‑7蛋白或其片段的多肽。所公开的多肽可用于治疗癌症。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有IL-7活性的双功能分子本申请要求2019年7月25日提交的PCT/CN2019/097772的优先权。上述申请的全部内容通过引用并入本文。
技术介绍
白细胞介素7(IL-7)是一种由骨髓和胸腺中的基质细胞分泌的造血生长因子。IL-7促进多能造血干细胞向淋巴祖细胞分化。它还刺激淋巴系中所有细胞(B细胞、T细胞和NK细胞)的增殖。IL-7是B、T细胞发育的重要细胞因子。这种细胞因子和肝细胞生长因子(HGF)形成一种异二聚体，从而作为前B细胞(pre-pro-Bcell)生长刺激因子发挥作用。这种细胞因子在早期T细胞发育过程中被发现是T细胞受体β(TCRβ)的V(D)J重排的辅助因子。这种细胞因子可由肠上皮和上皮杯状细胞局部产生，并可作为肠粘膜淋巴细胞的调节因子。在多个I期和II期临床试验中重组IL-7已安全地应用于患者。一项针对癌症患者IL-7的人体研究表明，施用这种细胞因子可以瞬间破坏CD8+和CD4+T细胞的稳态，同时相应降低CD4+CD25+Foxp3+T调节细胞的百分比。然而，没有观察到客观的癌症消退。概述本专利技术比较了不同形式的双功能分子，其中包括一种或多种IL-7蛋白或其变体以及对肿瘤抗原或免疫检查点分子(例如PD-L1)具有特异性的抗体或抗原结合片段。发现当IL-7蛋白或其变体与Fc片段的N-末端融合，而抗原结合片段与Fc片段的另一条链的N-末端融合时，双功能分子具有最高的稳定性和优异的活性。因此，根据本专利技术的一个实施方案，提供一种多肽，其具有对肿瘤抗原或免疫检查点分子具有特异性的抗原结合单元；以及IL-7蛋白或同源物，二者最好融合到Fc片段的N-末端。在一些实施方案中，提供了一种多肽，其包含：第一部分，从N-末端到C-末端依次包含第一片段、CH2片段和CH3片段，其中第一片段包含IL-7蛋白、与IL-7蛋白具有至少75％序列同源性的IL-7蛋白质同源物或其片段，其中第一片段能够结合IL-7受体；以及第二部分，从N-末端到C-末端依次包含抗原结合片段、CH2片段和CH3片段，其中所述抗原结合片段能够特异性地结合肿瘤抗原或免疫检查点分子，其中第一部分通过CH2片段和/或CH3片段之间的相互作用与第二部分配对。本专利技术还针对需要治疗癌症的患者提供了治疗癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法需要向患者施用本专利技术的分子。在一些实施方案中，所述癌症选自由膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑色素瘤、前列腺癌和甲状腺癌组成的组。附图说明图1显示了血清中的浓度-时间曲线和受试双功能分子的药代动力学参数。图2显示了双功能分子处理后的绝对细胞数量。图3(A-B)显示了双功能分子治疗后，通过CD4+或CD8+T细胞上Ki67表达测定的T细胞增殖变化。图4(A-B)显示了P-STAT5+CD4+T细胞和IL7Rα在指定治疗后的表达水平百分比的变化。图5显示了形式1、2和3的结构。图6显示了小鼠单剂量服用受试双功能分子后，L1I7形式1、2和3的完整分子和抗PD-L1部分的血清浓度。图7显示了在单剂量受试双功能分子后血清中的浓度-时间曲线和L1I7WT的药代动力学参数。图8显示了L1I7WT形式2处理后的绝对细胞计数。图9(A-B)显示了L1I7WT形式2处理后Ki67+CD4+和Ki67+CD8+T细胞的百分比变化。图10显示了通过Biacore测量的L1I7形式2分子的PD-L1结合亲和力。图11显示了为分析其与人PD-L1结合而进行的双功能分子的ELISA(A-B)和细胞结合(C-D)结果。图12(A-B)显示了基于细胞的功能分析，验证了L1I7融合分子的PDL1拮抗作用。图13(A-B)显示了人CD4+T细胞中P-STAT5的MFI在指定治疗后的变化。图14(A-D)显示了经过指定治疗后，IL-7R结合和连接诱导的人CD4+T细胞内化。图15(A-B)显示了经过指定治疗后的CD4+T细胞增殖。图16显示了经过指定治疗后的体外T细胞活化效应。图17(A-B)显示了PBMC重组HCC1954肿瘤细胞移植小鼠体内所示分子的跟踪和组织分布。图18显示了L1I7分子与IL-7Rα和PD-L1的双特异性结合曲线。图19显示了食蟹猴第一剂量的L1I7形式2系列分子的PK曲线。图20(A-D)显示了连续三次静脉注射L1I7系列分子后食蟹猴的血液学参数。图21(A-D)显示了在食蟹猴体内连续三次静脉注射L1I7分子后的T细胞增殖。专利技术详述定义应当注意的是，术语“一种”实体是指一种或多种该实体，例如“一种抗体”应当被理解为一种或多种抗体，因此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”可以在本文中互换使用。在本专利技术中，术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何单条链或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸链的任何其他术语，并且术语“多肽”可以用来代替上述任何一个术语，或者与上述任何一个术语交替使用。术语“多肽”也意在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但其不必从指定的核酸序列翻译所得。它可能以包括化学合成的任何方式产生。本专利技术中关于细胞、核酸所使用的术语“分离的”，例如“分离的”DNA或RNA是指分别与存在于大分子的天然来源中的其它DNA或RNA所分离的分子。本专利技术使用的术语“分离的”还指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或细胞培养基的核酸或肽，或化学合成时的化学前体或其他化学品。此外，“分离的核酸”意在包括不以天然状态存在的核酸片段，并且不会以天然状态存在。术语“分离的”在本专利技术中也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽意在包括纯化的和重组的多肽。在本专利技术中，术语“重组”涉及多肽或多聚核苷酸，意指非天然存在的多肽或多聚核苷酸的形式，不受限制的实施例可以通过组合产生通常并不存在的多聚核苷酸或多肽。“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中可以比对的位置来确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度是由序列共有的匹配或同源位置的数目组成的一个函数。术语“不相关的”或“非同源的”序列表示与本专利技术公开的序列之一有小于40％的同一性，但优选小于25％的同一性。多聚核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多肽，其包含：/n第一部分，从N-末端到C-末端依次包含第一片段、CH2片段和CH3片段，其中所述第一片段包含IL-7蛋白、与IL-7蛋白质具有至少75％序列同源性的IL-7蛋白同源物或其片段，其中所述第一片段能够结合IL-7受体；和/n第二部分，从N-末端到C-末端依次包含抗原结合片段、CH2片段和CH3片段，其中所述抗原结合片段能够特异性结合肿瘤抗原或免疫检查点分子，/n其中，所述第一部分通过CH2片段和/或CH3片段之间的相互作用与第二部分配对。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20190725 CN PCT/CN2019/0977721.一种多肽，其包含：
第一部分，从N-末端到C-末端依次包含第一片段、CH2片段和CH3片段，其中所述第一片段包含IL-7蛋白、与IL-7蛋白质具有至少75％序列同源性的IL-7蛋白同源物或其片段，其中所述第一片段能够结合IL-7受体；和
第二部分，从N-末端到C-末端依次包含抗原结合片段、CH2片段和CH3片段，其中所述抗原结合片段能够特异性结合肿瘤抗原或免疫检查点分子，
其中，所述第一部分通过CH2片段和/或CH3片段之间的相互作用与第二部分配对。


2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，与野生型IL-7蛋白相比，所述第一部分的所述第一片段具有增加的或减少的对IL-7受体α的结合亲和力、增加的或减少的稳定性、增加的或减少的IL-7活性、增加的或减少的IL-7信号传导、或减少的免疫原性。


3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，与野生型IL-7蛋白相比，所述第一部分的所述第一片段具有减少的IL-7受体α的结合亲和力或减少的IL-7信号传导。


4.如权利要求1-3任一项所述的多肽，其特征在于，所述第一部分的所述第一片段包含如SEQIDNO:7所示的氨基酸序列或与SEQIDNO:7具有至少75％序列同源性的肽。


5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述肽在根据SEQIDNO:7编号的位点142处具有疏水性氨基酸残基。


6.如权利要求5所述的多肽，其特征在于，所述疏水性氨基酸残基选自由G、A、V、C、L、I、M及F组成的组。


7.如权利要求5所述的多肽，其特征在于，所述疏水性氨基酸残基选自由A、V、L、I、M及F组成的组。


8.如权利要求1-7任一项所述的多肽，其特征在于，所述第一部分的所述第一片段包含如SEQIDNO:7、8、9或10所示的氨基酸序列。


9.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述第一部分的所述第一片段包含至少四个所述IL-7蛋白或IL-7同源物的α螺旋基序。


10.如权利要求1-9任一项所述的多肽，其特征在于，所述抗原结合片段包含Fab片段、单链可变片段(scFv)、纳米体、抗原结合基序或其组合。


11.如权利要求1-10任一项所述的多肽，其特征在于，所述抗原结合片段包含至少两个抗原结合单元。


12.如权利要求1-11任一项所述的多肽，其特征在于，所述肿瘤抗原或免疫检查点选自由EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CD73、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、CIX、PSMA、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、整合素，αVβ3、α5β1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、韧粘素、PD-L1、PD-1、CTLA-4、LAG-3、CD28、CD122、4-1BB、TIM3、OX-40、OX40L、CD40、CD40L、LIGHT、ICOS、ICOSL、GITR、GITRL、TIGIT、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM和BTLA组成的组。


13.如权利要求1-12任一项所述的多肽，其特征在于，所述抗原结合片段能够特异性结合人PD-L1蛋白。


14.如权利要求13所述的多肽，其特征在于，所述抗原结合片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区包含CDR1、CDR2及CDR3，所述CDR1、CDR2及CDR3分别具有SEQIDNO:1、3、4或5的残基31-35、残基50-66及残基99-108的氨基酸序列。


15.如权利要求13或14所述的多肽，其特征在于，所述抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2及CDR3，所述CDR1、...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔菲菲，方磊，杨园园，王正毅，郭炳诗，
申请(专利权)人：天境生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31