新型冠状病毒S蛋白及其亚单位疫苗制造技术

本发明专利技术提供了一种新型冠状病毒S蛋白及其亚单位疫苗，所述新型冠状病毒S蛋白的S1/S2两个亚基之间的furin裂解位点682‑RRAR‑685替换为柔性的蛋白linker，所述linker为以甘氨酸G和丝氨酸S构成的GSAS、GS组合、(GGGS)

【技术实现步骤摘要】
新型冠状病毒S蛋白及其亚单位疫苗
本专利技术属于生物
，涉及一种新型冠状病毒S蛋白及其亚单位疫苗。
技术介绍
2020年1月30日，世卫组织宣布新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引发的全球疫情为国际关注的突发公共卫生事件。由于病毒极高的传播潜力，截至2021年3月20日，全球已累计报告超过1.23亿例SARS-CoV-2感染病例，导致2718896例患者死亡。为了应对全球大流行的新型冠状病毒肺炎疫情，各国政府、企业和学术界正在制定各种治疗和预防对策，重中之重是疫苗和抗病毒药物的研发与应用。疫苗是抵抗所有病毒性疾病感染最有效的手段，也是保护未感染人群最有效的措施。目前在研或已获批上市的SARS-CoV-2疫苗类型有：灭活疫苗、腺病毒载体疫苗、核酸疫苗(包括mRNA疫苗和DNA疫苗)以及亚单位疫苗。虽然已有部分针对SARS-CoV-2的疫苗紧急上市，用于应急使用，但目前的疫苗品种仍有很多问题：1、我国主要使用的灭活疫苗相比于核酸疫苗和亚单位疫苗的免疫原性不够强，灭活试剂会对抗原天然表位产生破环，而病毒颗粒中的其他但蛋白也会干扰S蛋白的免疫原性。2、核酸类疫苗产品是在新冠病毒中首次应用，以前还没有成功上市的核酸类疫苗，其长期的安全性，整合风险都未知。3、腺病毒疫苗的腺病毒载体会受到预存免疫的干扰。4、现有各种疫苗搜身针对早期流行毒株设计的，无法有效应对已经产生的突变株，不具有保守的保护效果。由于亚单位疫苗是采用SARS-CoV-2S蛋白全长或部分氨基酸序列作为抗原，具有强免疫原性，可以诱导高滴度的中和抗体产生，基因重组技术也便于对抗原进行突变株更新和广谱性设计，因此亚单位疫苗在应对SARS-CoV-2突变株具有更大的优势。SARS-CoV-2是一种基因组约30kb，是有包膜的单股正链RNA病毒，属于冠状病毒家族β属。病毒基因组编码多种蛋白，包括刺突蛋白(S)，膜糖蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)，膜蛋白(E)以及多种非结构蛋白。其中S蛋白是I型病毒融合蛋白，介导病毒附着在细胞表面受体血管紧张素转化酶2(ACE2)上，然后释放基因组进入细胞，因此S蛋白是中和性抗体的靶点，也是疫苗制备的主要有效成分。新型冠状病毒S蛋白由1273个氨基酸组成，包含21-35个N-糖基化位点。S蛋白以三聚体的形式在病毒表面形成特殊的花冠结构，冠状病毒因此而得名。S蛋白在宿主细胞蛋白酶的作用下，通过蛋白中部的RRAR剪切序列被裂解为S1和S2两个亚基，S1主要功能是与宿主细胞表面受体结合，S2亚基介导病毒-细胞以及细胞-细胞膜融合。S蛋白完整的三聚体结构是病毒被宿主细胞核中和性抗体识别的首要结构。因此，亟需开发一种新的有效的针对新型冠状病毒的疫苗。
技术实现思路
为了解决所述技术问题，本专利技术提供了一种新型冠状病毒S蛋白及其亚单位疫苗，S1/S2切割位点RRAR经突变以失去被弗林样蛋白酶切割的能力，以保留完整的S蛋白抗原性。在本专利技术的第一方面，提供了一种新型冠状病毒S蛋白，所述新型冠状病毒S蛋白的S1/S2两个亚基之间的Furin裂解位点682-RRAR-685替换为柔性的蛋白linker，所述linker为以甘氨酸G和丝氨酸S构成的GSAS、GS组合、(GGGS)n或者(GGGGS)n或者(G)n，其中，n为≥1的整数。进一步地，所述新型冠状病毒S蛋白具有如下修饰1-修饰4中的至少一种：修饰1、所述新型冠状病毒S蛋白的原始信号肽替换为tPA信号肽、CD5信号肽和IgG信号肽中的一种；修饰2、所述新型冠状病毒S蛋白的SEQIDNO：24所示跨膜区替换为T4噬菌体fibritin三聚体基序或SEQIDNO:25GCN4多聚体形成基序；修饰3、所述新型冠状病毒S蛋白的C端结构域删除SEQIDNO：7所示跨膜结构域；修饰4、所述新型冠状病毒S蛋白在氨基酸位置817-987处具有一个或多个氨基酸残基突变为脯氨酸的突变，所述突变包括K986P和/或V987P取代。进一步地，所述新型冠状病毒S蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示或者SEQIDNO：10所示或者SEQIDNO：12所示。进一步地，所述新型冠状病毒S蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：9所示或者SEQIDNO：11所示或者SEQIDNO：13所示。在本专利技术的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示或者SEQIDNO：10所示或者SEQIDNO：12所示。在本专利技术的第三方面，提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体能够表达所述的新型冠状病毒S蛋白。进一步地，所述重组表达载体的表达区的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示或者SEQIDNO：10所示或者SEQIDNO：12所示。在本专利技术的第四方面，提供了一种工程化细胞，所述工程化细胞包含所述的重组表达载体。在本专利技术的第五方面，提供了一种新型冠状病毒S蛋白的制备方法，所述方法包括：获得所述的重组表达载体；将所述重组表达载体转染至细胞中，并通过细胞群的谷氨酰胺抗性筛选以及单克隆筛选，获得稳定表达重组S蛋白的细胞株；将所述细胞株进行分泌表达和纯化，获得纯化的重组新型冠状病毒S蛋白。在本专利技术的第六方面，提供了一种新型冠状病毒亚单位疫苗，所述新型冠状病毒亚单位疫苗包含所述的重组S蛋白以及药学上接受的佐剂。进一步，所述佐剂包括氢氧化铝、卵磷脂、弗氏佐剂、MPLTM、IL-12、氢氧化铝联合CpGODN复合佐剂、ISA51VG、ISA720VG、MF59、QS21、AS03佐剂中的至少一种。本专利技术实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：本专利技术提供的新型冠状病毒S蛋白及其亚单位疫苗，本专利技术的免疫原S蛋白多肽具有稳定的融合前构象，将S1/S2两个亚基之间的Furin裂解位点682-RRAR-685替换为柔性的蛋白linker,如以G(Gly)甘氨酸和S(Ser)丝氨酸构成的GSAS、GS组合、(GGGS)n或者(GGGGS)n或者(G)n，通过n来调整linker的长度和效果。在本专利技术中，我们比较了多种柔性linker，图2B的结果表明，与已经报道的682-QQAQ-685突变相比，GS柔性linker，包括682-GSAS-685，682-GG-685都具有更好的保护剪切的效果，GS突变中S2的剪切更少，能更好地保持不被剪切的S蛋白形式。本专利技术应用获取的具有生物活性的三聚体构象的S蛋白，制备成三聚体亚单位疫苗，免疫小鼠后能够诱导小鼠产生针对SARS-CoV-2原始株以及目前流行的突变株都具有免疫保护作用的中和抗体，对免疫小鼠进行新型冠状病毒的致死性攻毒感染后，可以提供100％的保护效率。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型冠状病毒S蛋白，其特征在于，所述新型冠状病毒S蛋白的S1/S2两个亚基之间的furin裂解位点682-RRAR-685替换为柔性的蛋白linker，所述linker为以甘氨酸G和丝氨酸S构成的GSAS、GS组合、(GGGS)

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒S蛋白，其特征在于，所述新型冠状病毒S蛋白的S1/S2两个亚基之间的furin裂解位点682-RRAR-685替换为柔性的蛋白linker，所述linker为以甘氨酸G和丝氨酸S构成的GSAS、GS组合、(GGGS)n或者(GGGGS)n或者(G)n，其中，n为≥1的整数。


2.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒S蛋白，其特征在于，所述新型冠状病毒S蛋白具有如下修饰1-修饰4中的至少一种：
修饰1、所述新型冠状病毒S蛋白的原始信号肽替换为tPA信号肽、CD5信号肽和IgG信号肽中的一种；
修饰2、所述新型冠状病毒S蛋白跨膜区替换为SEQIDNO：24所示的T4噬菌体fibritin三聚体基序或SEQIDNO:25GCN4多聚体形成基序；
修饰3、所述新型冠状病毒S蛋白的C端结构域删除SEQIDNO：26所示跨膜结构域；
修饰4、所述新型冠状病毒S蛋白在氨基酸位置817-987处具有一个或多个氨基酸残基突变为脯氨酸的突变，所述突变包括K986P和/或V987P取代。


3.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒S蛋白，其特征在于，所述新型冠状病毒S蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示或者SEQIDNO：10所示或者SEQIDNO：12所示。


4.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒S蛋白，其特征在于，所述新型冠状病毒S蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：9所示或者SEQIDNO：11所示或者SEQIDNO：13所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐可，蓝柯，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42