一种酿酒酵母表达长效重组III型胶原蛋白及其在化妆品中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种酿酒酵母表达长效重组III型胶原蛋白及其在化妆品中的应用。该长效重组III型胶原蛋白的氨基酸序列包括基本重复单元及末端氨基酸序列。基本重复单元包括人III型胶原肽段，人III型胶原肽段的氨基酸序列为：GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP。末端氨基酸序列包括人II型胶原肽段，人II型胶原肽段的氨基酸序列为：GPPGPCCGGG。本发明专利技术中的长效重组III型胶原蛋白具有良好的生物相容性、良好的细胞黏附性、能促进新细胞形成、具有止血功能，而且其促进上皮细胞生长功能更强。且本发明专利技术中的长效重组III型胶原蛋白与从动物组织和异体中提取的胶原蛋白相比的优势在于其可溶性、无病毒隐患和排异反应低。

【技术实现步骤摘要】
一种酿酒酵母表达长效重组III型胶原蛋白及其在化妆品中的应用
本专利技术涉及新兴生物医学领域，尤其涉及一种酿酒酵母表达长效重组III型胶原蛋白，一种长效重组III型胶原蛋白的活性检测方法，以及一种酿酒酵母表达长效重组III型胶原蛋白在化妆品中的应用。
技术介绍
胶原(collagen)，早期的定义是“生成胶的产物”。胶原的形态一般是白色、透明、无分支的原纤维。胶原的氨基酸组成有以下特点：甘氨酸(Gly，G)占总氨基酸残基的33％，即每隔两个其他氨基酸(X，Y)就有一个甘氨酸，所以其肽链可以用(G-X-Y)-来表示；X与Y可以是任意氨基酸，但X通常是脯氨酸(Pro，P)，Y通常是羟脯氨酸(HyP，P*)与羟赖氨酸(Hyl，K*)。目前，己经可以分离得到20余种天然胶原，根据发现次序依次被称为I型、II型胶原等，分布于动物的皮肤、骨骼、韧带、内脏、血管、虹膜、角膜等结缔组织中，具有支撑器官、保护机体的功能。胶原具有很强的生物活性及生物功能，使结缔组织具有机械强度，还能促进细胞生长，具有止血、生物相容性和生物降解性。基于这些特性，胶原在烧伤、创伤、美容、矫形、硬组织修复、创面止血、药物传递、缓释技术等医药卫生领域有着广泛的应用。III型胶原在血管中的含量比较高，主要存在于肺泡的间质中，并且分布比较杂乱，会构成比较复杂的网状结构。正是由于这种网状结构使得肺组织，尤其是肺泡间质，可以保持良好的柔韧性和一定的弹性，同时为细胞提供所需的养分，并且直接与血管的母细胞结合，可以促进心血管的形成。这与皮肤的饱满程度、润焕程度和光泽度都具有紧密的联系。由于天然胶原的不溶性、大分子性和特殊的翻译后修饰(羟基化、糖基化、相互交联，且受多种生物酶的复杂调控)，对其原始序列直接进行原核或酵母真核异源表达，却期望获得三重螺旋构象的胶原的可行性为零。
技术实现思路
针对现有的技术问题：由于天然胶原的不溶性、大分子性和特殊的翻译后修饰(羟基化、糖基化、相互交联，且受多种生物酶的复杂调控)，对其原始序列直接进行原核或酵母真核异源表达，却期望获得三重螺旋构象的胶原的可行性为零，本专利技术提供一种酿酒酵母表达长效重组III型胶原蛋白、一种长效重组III型胶原蛋白的活性检测方法、以及一种酿酒酵母表达长效重组III型胶原蛋白在化妆品中的应用。本专利技术采用以下技术方案实现：一种酿酒酵母表达长效重组III型胶原蛋白，长效重组III型胶原蛋白的氨基酸序列包括基本重复单元及末端氨基酸序列；基本重复单元包括人III型胶原肽段，人III型胶原肽段的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；末端氨基酸序列包括人II型胶原肽段，人II型胶原肽段的氨基酸序列为GPPGPCCGGG。作为上一步技术方案的改进，长效重组III型胶原蛋白的核苷酸序列包括起始密码子、终止密码子及6×His标签序列。作为上一步技术方案的进一步改进，长效重组III型胶原蛋白的核苷酸序列还包括NotI酶切位点、XbaI酶切位点。作为上一步技术方案的进一步改进，长效重组III型胶原蛋白的核苷酸序列是通过酵母密码子优化人胶原的核苷酸序列获得的，优化包括减少重复序列的重复频率对人胶原的核苷酸序列进行人工设计。作为上一步技术方案的改进，长效重组III型胶原蛋白的核苷酸序列如SeqIDNO.1所示，长效重组III型胶原蛋白的核苷酸序列所对应的氨基酸序列如SeqIDNO.2所示。本专利技术还提供一种长效重组III型胶原蛋白的活性检测方法，该活性检测方法采用如上任意一项所述的长效重组III型胶原蛋白；活性检测方法包括试剂配制、测定操作及测定方法。作为上一步技术方案的改进，试剂包括完全培养液、维持培养液、消化液、噻唑蓝溶液、PBS缓冲液。作为上一步技术方案的改进，测定操作包括重组人胶原蛋白供试品制备。作为上一步技术方案的改进，测定方法包括以下步骤：步骤一、细胞株的培养，细胞株为BALB/C3T3细胞株；步骤二、制备细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔板；步骤三、用维持培养液维持细胞生存；步骤四、细胞的加样处理；步骤五、根据MTT比色法测定吸光度，记录测定结果，并完成四参数拟合计算；步骤六、根据测定结果判断长效重组III型胶原蛋白的活性。本专利技术还提供一种酿酒酵母表达长效重组III型胶原蛋白在化妆品中的应用，其特征在于，其采用如上任意一项所述的长效重组III型胶原蛋白。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术通过减少重复序列的重复频率(获得小分子量蛋白)等手段对人胶原的序列进行人工设计，异源表达后获得长效重组III型胶原蛋白。2、本专利技术提供的长效重组III型胶原蛋白具有良好的生物相容性、良好的细胞黏附性、能促进新细胞形成、具有止血功能，而且其促进上皮细胞生长功能更强。3、本专利技术提供的长效重组III型胶原蛋白与从动物组织和异体中提取的胶原蛋白相比的优势在于其可溶性、无病毒隐患和排异反应低。序列表说明(序列表内容单独提供)SeqIDNO.1所示为本专利技术实施例中长效重组III型胶原蛋白的核苷酸序列。SeqIDNO.2所示为本专利技术实施例中长效重组III型胶原蛋白的氨基酸序列。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1本实施例提供了一种酿酒酵母表达长效重组III型胶原蛋白，该胶原蛋白的氨基酸序列包括基本重复单元及末端氨基酸序列；所述基本重复单元包括人III型胶原肽段，人III型胶原肽段的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；末端氨基酸序列包括人II型胶原肽段，人II型胶原肽段的氨基酸序列为GPPGPCCGGG。长效重组III型胶原蛋白的核苷酸序列包括NotI酶切位点、XbaI酶切位点、起始密码子、终止密码子及6×His标签序列。NotI酶切位点的核苷酸序列为GCGGCCGC；XbaI酶切位点的核苷酸序列为TCTAGA；起始密码子的核苷酸序列为ATG；终止密码子的核苷酸序列为TAA。所述长效重组III型胶原蛋白的核苷酸序列是通过酵母密码子优化人胶原的核苷酸序列获得的，所述优化包括减少重复序列的重复频率对所述人胶原的核苷酸序列进行人工设计。经酵母密码子优化后的核苷酸序列为：GCGGCCGCAATGGGTGAAAGAGGTGCTCCAGGTTTTAGAGGACCAGCCGGACCAAATGGAATTCCTGGCGAGAAAGGTCCTGCTGGAGAAAGGGGAGCACCTGGTGAAAGAGGAGCTCCAGGTTTCAGAGGGCCTGCTGGTCCGAATGGAATCCCGGGTGAGAAGGGTCCTGCTGGTGAGCGTGGTGCACCTGGAGAGCGTGGAGCACCTGGTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酿酒酵母表达长效重组III型胶原蛋白，其特征在于，所述长效重组III型胶原蛋白的氨基酸序列包括基本重复单元及末端氨基酸序列；/n所述基本重复单元包括人III型胶原肽段，所述人III型胶原肽段的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；/n所述末端氨基酸序列包括人II型胶原肽段，所述人II型胶原肽段的氨基酸序列为GPPGPCCGGG。/n

【技术特征摘要】
1.一种酿酒酵母表达长效重组III型胶原蛋白，其特征在于，所述长效重组III型胶原蛋白的氨基酸序列包括基本重复单元及末端氨基酸序列；
所述基本重复单元包括人III型胶原肽段，所述人III型胶原肽段的氨基酸序列为GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP；
所述末端氨基酸序列包括人II型胶原肽段，所述人II型胶原肽段的氨基酸序列为GPPGPCCGGG。


2.如权利要求1所述的酿酒酵母表达长效重组III型胶原蛋白，其特征在于，所述长效重组III型胶原蛋白的核苷酸序列包括起始密码子、终止密码子及6×His标签序列。


3.如权利要求2所述的酿酒酵母表达长效重组III型胶原蛋白，其特征在于，所述长效重组III型胶原蛋白的核苷酸序列还包括NotI酶切位点、XbaI酶切位点。


4.如权利要求2所述的酿酒酵母表达长效重组III型胶原蛋白，其特征在于，所述长效重组III型胶原蛋白的核苷酸序列是通过酵母密码子优化人胶原的核苷酸序列获得的，所述优化包括减少重复序列的重复频率对所述人胶原的核苷酸序列进行人工设计。


5.如权利要求1所述的酿酒酵母表达长效重组III型胶原蛋白，其特征在于，所述长效重组III型胶原蛋白的核苷酸序列如SeqIDNO.1所示，所述长效重组III型胶原蛋白的核苷酸序列所...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵俊，王梦，许高涛，何志远，刘家炉，金巢，孔国庆，
申请(专利权)人：芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34