一种表皮生长因子-溶菌酶融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种表皮生长因子‑溶菌酶融合蛋白及其提高植物中表皮生长因子EGF表达量和制备治疗溃疡或/和伤口愈合药物中的应用，所述融合蛋白是将表皮生长因子EGF和溶菌酶LYZ用连接肽链接构成。本发明专利技术通过EGF与溶菌酶融合表达，可以增加EGF的表达量，提高EGF的稳定性；EGF与溶菌酶融合表达后获得的新蛋白同时具备EGF与溶菌酶的生物功能，在伤口或溃疡的治疗方面具有增效作用。

【技术实现步骤摘要】
一种表皮生长因子-溶菌酶融合蛋白及其应用(一)
本专利技术涉及一种表皮生长因子与溶菌酶融合蛋白、编码基因及其应用。(二)
技术介绍
表皮生长因子(EGF，EpidermalGrowthFactor)是一种小肽，由53个氨基酸残基组成，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。人类表皮生长因子(hEGF)是一种由53个氨基酸残基和3个分子内二硫键组成的6.2kda多聚肽(CarpenterGetal.JBiolChem.1990)。hEGF主要生物学功能之一是促进上皮细胞和内皮细胞的生成，促进组织修复，它能加速因溃疡和伤口等原因而受损组织的愈合过程(SchultzGetal.JCellBiochem.1991)。hEGF在治疗皱纹、老年斑、雀斑和痤疮方面也很有效。传统上，hEGF从动物尿液中经过复杂的纯化步骤来纯化。然而，该工艺的hEGF收率和纯度较低，不能满足工业生产的需要。基因工程是一种可以大规模生产纯hEGF的方法。近二十年来，hEGF在大肠杆菌、短芽孢杆菌、酿酒酵母和杆状病毒等多种宿主系统中产生。在大肠杆菌中，hEGF的产量达不到工业需要的水平，因为细胞质hEGF倾向于形成包涵体，而包涵体可以被蛋白酶迅速降解，导致hEGF的错误折叠。同时，由于从包合体释放hEGF所需的额外下游处理步骤，使得总体生产成本增加。此外，与真核生物系统相比，由于缺少翻译后修饰，原核系统产生的hEGF具有较低的生物活性。因此，真核表达系统可能是大规模生产高活性hEGF的最好选择。但是目前，在真核系统中，EGF的表达量都非常低，严重限制了利用真核系统成产重组EGF的产业化。比如，在烟草中表达的EGF只占到总可溶蛋白的0.000006％，即20-60pg/mg(Higoetal.BiosciBiotechnolBiochem.1993)。即使在优化后也只在烟草叶片中达到总可溶蛋白的0.3％(Bai,Jie-Ying,etal.Biotechnologyletters.2007)，在大豆种子中达到6.7+/-3.1to129.0+/-36.7μgEGF/g(He,Yonghua,etal.PloSone.2016)。因此，提高EGF在真核表达系统，特别是在植物表达系统中的表达量非常急迫。溶菌酶(Lysozyme，LYZ)，又称胞壁质酶(muramidase)，其化学名称为N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramideglycanohydrlase)，是一种稳定的碱性蛋白酶。它可对细菌细胞壁肽聚糖中的N-乙酰葡萄糖胺、以及N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键进行水解，促进细菌细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，降低细菌细胞壁的稳定性，导致细胞壁裂解内容物溢出，并最终引起细菌溶解。在与带负电荷的病毒蛋白相互结合的情况下，溶菌酶能够与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐。这种复盐具有使病毒失去活力的特性。研究表明，溶菌酶能够在不破坏其他组织的前提下，有选择地对微生物的细胞壁进行分解。这种特性就使得溶菌酶具有抗菌消炎、抗病毒、增强免疫力、促进双歧杆菌等有益菌增殖的独特功效。溶菌酶分为3型：C型、G型和噬菌体溶菌酶。人源溶菌酶(Humanlysozyme，hLY)属于C型溶菌酶，由130个氨基酸残基组成，相对分子质量为15kda，其由单核巨噬细胞分泌，在机体内具有非特异性防御作用(Huang,Jianmin,etal.MolecularBreeding2002)。从自然界中提取人源溶菌酶主要是从人白细胞或人乳中提取，产量低，价格昂贵，无法应用于临床。但是有科学家尝试在水稻种子中表达人溶菌酶，获得的转化体中，溶菌酶蛋白的含量达到了稻米重量的0.6％，占可溶蛋白的45％(Huang,Jianmin,etal.MolecularBreeding.2002)。融合基因是指通过分子生物学的方法把两个不同的基因或者DNA片段连接起来形成一个新基因的方法。所获得融合基因表达的蛋白可能同时具有融合之前的两个蛋白的功能。但是由于蛋白功能受到蛋白质氨基酸序列的一级结构、二级结构和高级结构的影响，所以不同的基因融合后获得的融合蛋白的功能和性状往往是不可预知的，需要通过具体的研究分析获得结果。我们意外的发现，利用我们的方法将EGF与溶菌酶融合表达后，获得的融合蛋白中EGF的表达量增加，稳定性增强。而且，融合蛋白同时具备EGF和溶菌酶的生物学活性。目前市面上在售的EGF主要是通过原核表达系统-大肠杆菌表达获得，不但生产成本高而且由于缺少翻译后修饰，生物活性较低。目前已经有很多研究者试图通过真核表达系统来生产重组EGF，但是表达量都非常低，远达不到产业化的水平。因此亟需提高真核表达系统特别是植物生物反应器中EGF的表达量。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种表皮生长因子-溶菌酶融合蛋白，通过将表皮生长因子EGF和溶菌酶LYZ融合表达，获得具有表皮生长因子的促进细胞分裂的作用和溶菌酶的杀菌作用融合蛋白的同时，还能提高表皮生长因子EGF的表达量法；由于溶菌酶具有杀菌作用，在处理溃疡或者伤口愈合上，与EGF形成增效作用，解决现有表皮生长因子EGF生物活性低，表达量低的问题。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供了一种表皮生长因子-溶菌酶融合蛋白，所述融合蛋白是将表皮生长因子(EGF)和溶菌酶(LYZ)用连接肽链接构成，即以表皮生长因子、连接肽、溶菌酶的顺序依次链接或者以溶菌酶、连接肽、表皮生长因子的顺序依次链接。进一步，所述表皮生长因子可以来源于人或者哺乳动物，不限于表1所示，优选人源表皮生长因子，核苷酸序列为SEQIDNO.7所示。表1、不同来源的表皮生长因子及氨基酸序列进一步，所述溶菌酶可以来源于原核生物或者真核生物，不限于表2所示，优选核苷酸序列为SEQIDNO.8所示。表2、不同来源的溶菌酶及氨基酸序列登陆号溶菌酶来源NCBISequenceID人(Human)1IWT_A鸡蛋(HenEgg)1LZD_A羊(Sheep)P80190.1牛(Cattle)AAB26394.1海藻(algae)PRW61607.1进一步，所述连接肽氨基酸序列为SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。当连接肽氨基酸序列为SEQIDNO.1所示时，所述表皮生长因子-溶菌酶融合蛋白(记为EGF-LG-L)氨基酸序列为SEQIDNO.5所示，编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示。当连接肽氨基酸序列为SEQIDNO.2所示时，所述表皮生长因子-溶菌酶融合蛋白(记为EGF-LRG-L)氨基酸序列为SEQIDNO.6所示，编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.4所示。本专利技术提供了一种含有表皮生长因子-溶菌酶融合蛋白编码基因的表达载体，这种表达载体可以是原核表达载体或者真核表达载体。本专利技术提供的真核表达载体包括但不限于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表皮生长因子-溶菌酶融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白是将表皮生长因子EGF和溶菌酶LYZ用连接肽链接构成。/n

【技术特征摘要】
1.一种表皮生长因子-溶菌酶融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白是将表皮生长因子EGF和溶菌酶LYZ用连接肽链接构成。


2.如权利要求1所述表皮生长因子-溶菌酶融合蛋白，其特征在于所述表皮生长因子EGF核苷酸序列为SEQIDNO.7所示。


3.如权利要求1所述表皮生长因子-溶菌酶融合蛋白，其特征在于所述溶菌酶LYZ核苷酸序列为SEQIDNO.8所示。


4.如权利要求1所述表皮生长因子-溶菌酶融合蛋白，其特征在于所述连接肽氨基酸序列为SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。


5.如权利要求1所述表皮生长因子-溶菌酶融合蛋白，其特征在于当连接肽氨基酸序列为SEQIDNO.1所示时，所述表皮生...

【专利技术属性】
技术研发人员：王东芳，张意红，
申请(专利权)人：杭州芳韵生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33