一种抗虫耐除草剂基因表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗虫耐除草剂基因表达载体及其应用，所述的表达载体含有抗虫基因cry1Ab、vip3A和cry2Ae，耐草甘膦基因cp4。本发明专利技术载体的转基因作物能够同时抗草地贪夜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等农作物的主要鳞翅目害虫，且抗性普遍高于只同时表达cry1Ab和cry2Ae的转基因植物，同时也有利于扩宽转基因作物的抗虫范围。另外，本发明专利技术在cry2Ae基因前面加了叶绿体信号肽序列，一方面增加了Cry2Ae蛋白的表达量，增加幅度为10％

【技术实现步骤摘要】
al.Appl.Environ.Microbiol.2002,68(8):3790
‑
3794.)。Cry1Ab与Cry2Ae蛋白功能区域的氨基酸相似度极低，仅为17.9％。因此，二者的杀虫谱差异很大，也不容易产生交付抗性，非常适合联合使用。Vip3A是一类对鳞翅目昆虫幼虫具有杀虫活性的蛋白质，从苏云金杆菌AB88中分离，在其生长的营养期、生长中期和产孢过程中均有表达。其基因产物对草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、甜菜夜蛾(Spodtera exigua)、烟草夜蛾(Heliothis Virescons)和美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)等鳞翅目昆虫幼虫有杀虫作用(Estruch,J J et al.Proceedings of the National Academy of Sciences.1996,93(11):5389
‑
5394)。Vip3A蛋白无论从一级结构还是高级结构上与Cry杀虫蛋白有显著差异，杀虫机理也显著不同。因此，通过Cry1Ab、Cry2Ae和Vip3A三种蛋白可以有效增强转基因植物对主要的鳞翅目害虫的杀虫性能、扩展杀虫普，并且能有效延缓害虫抗性产生。
[0005]杂草是影响农作物生产的第二大重要因素。它与农作物竞争水资源、肥料、光源等，造成农作物的产量降低，同时还会降低农产品的品质。传统的手工除草方法费时费力并且效率很低，机械除草费用较高，而化学药剂除草对技术要求较高并且极易对植物造成药害，影响作物本身的生长发育，同时化学药剂还可能会影响到邻近敏感的农作物。
[0006]目前，通过转基因的方法让植物耐受草甘膦是应用最广泛的杂草解决方案。草甘膦，化学名称为N
‑
(磷酸甲基)甘氨酸，是一种有机膦类除草剂，是一种内吸传导型广谱灭生性除草剂，拥有40多年的长期安全使用记录。可以通过在植物中表达CP4(来源于农杆菌CP4菌株，编码CP4
‑
EPSPS蛋白)(Padgette,S R et al.1996.Pages 53
‑
84in Herbicide
‑
Resistant Crops)等EPSPS基因和Gat(来源于土壤微生物宏基因组的草甘磷N
‑
乙酰转移酶的基因)等能表达降解草甘膦的酶的基因赋予植物耐草甘膦的性状。
[0007]让植物同时表达多种目的蛋白的方法主要包括多表达框分子克隆堆积法、杂交堆积法、基因融合法，其中多表达框分子克隆堆积法以其具备的稳定性好、可预见性强和后期植物转育容易等优势被广泛使用。而多表达框堆积策略的效果受诸多因素的影响，包括基因的选择、编码序列的选择、每个表达框包括启动子、终止子等在内的调控元件的选择、各读码框的排列等。这些因素都会对目的基因的表达水平、表达模式已经不同代次间的稳定性特别是高代次的基因沉默情况有不同的影响。因此一个能高效稳定的表达多个目的基因的表达载体需要经过严格的探索与测试，而这种载体对获得稳定高效的转基因作物起到决定性作用。
(三)
技术实现思路

[0008]本专利技术目的是提供一种同时稳定高效表达多种抗虫基因(如cry1Ab、vip3A、cry2Ae)和抗除草剂基因(如cp4基因)的双元载体，及其在制备抗虫耐草甘膦植物细胞、农作物方面的应用，转基因植物抗草甘膦除草剂的同时，高抗草地贪夜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等主要鳞翅目害虫，解决了现有转基因植物不能同时抗多种害虫且对杀虫蛋白产生抗性的问题。
[0009]本专利技术采用的技术方案是：
[0010]本专利技术提供一种同时稳定高效表达抗虫耐除草剂基因的表达载体，所述的表达载体含有抗虫基因cry1Ab、vip3A和cry2Ae，同时含耐草甘膦基因cp4。
Engineering,2007,12(6):676
‑
683.)、玉米HPS70基因的内含子等(Brown S M,Santino C G.CA2108000A1.1993.)。同时，终止子可以是来源于植物自身的终止子，也可以是来源于病毒和其它生物，或者人工合成的终止子。
[0018]进一步，本专利技术提供了一种用于增强cry2Ae基因表达的玉米EPSPS基因叶绿体信号肽序列，所述信号肽核苷酸序列如SEQ ID No：10所示。
[0019]进一步，本专利技术提供了一种用于增强cp4基因表达的水稻EPSPS基因叶绿体信号肽序列，所述信号肽核苷酸序列如SEQ ID No：11所示。
[0020]本专利技术中用于提供载体骨架的基础载体可以是pCambia系列载体(CAMBIA,Canberra,Australia)或者其它载体，优选pCambia 1300载体。
[0021]本专利技术所述表达载体T
‑
DNA组成：启动子
‑
cry2Ae基因
‑
启动子
‑
vip3A基因
‑
启动子
‑
cry1Ab基因
‑
启动子
‑
cp4基因。优选所述表达载体的T
‑
DNA：1300
‑
p35S
‑
intron
‑
cp4
‑
pZmUbi1
‑
cry1Ab
‑
p35S
‑
intron
‑
vip3A
‑
pZmUbi2
‑
cry2Ae。
[0022]本专利技术还提供一种所述表达载体在制备转基因植物细胞中的应用，所述的应用是将所述的表达载体电击转化农杆菌EHA105，获得含有表达载体的农杆菌菌株，用农杆菌菌液侵染植物，获得含表达载体的植物细胞。
[0023]本专利技术还提供了一种包含所述同时稳定高效表达抗虫耐草甘膦基因T
‑
DNA的植物细胞，在植物转基因细胞培养中将耐草甘膦基因cp4作为筛选标记。
[0024]本专利技术同时还提供了一种包含所述同时稳定高效表达抗虫耐草甘膦基因T
‑
DNA的转基因植物。
[0025]本专利技术进一步提供了利用所述载体获得同时稳定高效表达抗虫耐草甘膦基因的植物细胞或者植物的方法，该方法可以是农杆菌介导转化法、基因枪法、原生质体侵染法或者其他植物遗传转化方法，优选农杆菌介导转化法。
[0026]本专利技术构建的表达载体适于单子叶植物的表达或者双子叶植物的表达，单子叶植物包括：玉米、水稻等；双子叶植物包括：大豆、油菜、棉花等。
[0027]本专利技术所述表达载体转化农作物获得的转基因作物能够同时抗草地贪夜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等农作物的主要鳞翅目害虫。
[0028]与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术表达载体同时表达Cry1Ab、Vip3A、Cry2Ae和Cp4蛋白，用该载体转化农作物获得的转基因作物能够同本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗虫耐除草剂基因表达载体，其特征在于所述的表达载体含有抗虫基因cry1Ab、vip3A和cry2Ae，同时含耐草甘膦基因cp4。2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述抗虫基因cry1Ab核苷酸序列为SEQ ID No：1所示；所述抗虫基因vip3A核苷酸序列为SEQ ID No：3所示；所述抗虫基因cry2Ae核苷酸序列为SEQ ID No：5所示；所述耐草甘膦基因cp4的核苷酸序列为SEQ ID No：7所示。3.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述表达载体包含玉米泛素启动子pZmUbi、CaMV35S启动子。4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述cry1Ab和cry2Ae采用CaMV35S启动子；所述vip3A和cp4采用含玉米HSP70基因的内含子的启动子CaMV...

【专利技术属性】
技术研发人员：王东芳，张意红，
申请(专利权)人：杭州芳韵生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：