一种同时表达两种植物源耐除草剂突变基因的载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种同时表达两种植物源耐除草剂突变基因的载体及其应用，所述载体包含5

【技术实现步骤摘要】
一种同时表达两种植物源耐除草剂突变基因的载体及其应用
(一)

[0001]本专利技术属于植物生物
，具体涉及在植物中同时高效表达两种植物源耐除草剂突变基因的表达载体、构建方法及其在培育耐除草剂植物细胞和植物方面的应用。
(二)
技术介绍

[0002]近年来由于水资源的迅速枯竭和劳动力的短缺，许多亚洲地区的农民正在从水田移栽水稻的方式转向旱作水稻。然而，杂草危害是旱作水稻系统中的一个严重问题，因为旱作和好氧土壤条件有利于杂草的萌发和生长。杂草可以带来39
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41％的产量损失(Chauhan B S et al.Field Crops Research,2013,141(1):9
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15.)。而玉米、大豆、棉花等旱作作物一直以来饱受杂草侵害。
[0003]杂草防治的方法主要包括人工除草、机械除草、物理除草、化学除草、生物除草和生态除草。而化学除草是最主要的一种除草方法。利用除草剂防治杂草，在现代农业生产中起到了巨大的作用。但是，因为要防止对农作物造成危害，目前使用的除草剂大都是选择性除草剂，而这些除草剂普遍存在杀草谱窄，除草成本高等问题。
[0004]从1996年开始，转基因大豆和玉米等作物已经在美国和巴西等国家商业化种植，通过在植物中转入抗除草剂基因，可以赋予植物源耐除草剂的性状。目前推广应用的转基因植物中使用耐除草剂基因及其性状情况如表1所示。
[0005]表1：转基因植物中使用耐除草剂基因及其性状情况
[0006][0007]上述已经应用于商品化种植的转基因植物材料中的耐除草剂基因大多是来源于细菌等微生物。而目前，在植物中也发现了许多天然或者突变的具有耐除草剂性能的基因。
其中包括突变EPSPS(5
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enolpyruvylshikimate 3
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phosphate synthase，5
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烯醇丙酮酸莽草酸3
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磷酸合酶)基因和突变ALS(Acetolactate Synthase，乙酰乳酸合成酶)基因。EPSPS是植物合成分支酸盐的莽草酸途径中的一种关键酶，而分支酸酶是植物合成芳香族氨基酸(L
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色氨酸、L
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酪氨酸和L
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苯丙氨酸)所必须的(Funke T et al.2006,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103,13010
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13015.)。根据其固有的草甘膦敏感性和催化效率，EPSPS酶可分为两大类。第1类EPSPS(草甘膦敏感形)存在于所有植物和一些细菌中；第二类EPSPS目前只在一些细菌中发现，例如金黄色葡萄球菌、农杆菌CP4株和假单胞菌PG2982株对草甘膦既有固有的耐受性，又对PEP(phosphoenolpyruvate，磷酸烯醇式丙酮酸)有较高的亲和力(Achary,Vmm,et al.Plant Biotechnology Journal.2020,18:2504
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2519)。第一类EPEPS突变基因突变可以使得其具有耐草甘膦性能，例如突变的牛筋草(Eleusine indica)EPSPS基因(Yu Q et al.2015.Plant Physiol.167,1440
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1447.)，突变的玉米(Zeamays)EPSPS基因(Feng P C C et al.2010，pp.45
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66.Hoboken,NJ:John Wiley&Sons,Inc.)。ALS是支链氨基酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸生物合成途径中最常见的酶。已知ALS中特定氨基酸的突变使得突变后的ALS基因具有抗除草剂性能，这些除草剂包括磺酰脲(SUs)包括CS和BM，咪唑啉酮(IMs)包括IQ和IP，嘧啶基羧基除草剂(PCs)包括BS、PS和PM(Okuzaki A et al.Plant Mol Biol.2007,64:219
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224)。
[0008]基因功能除了由其自生的特性决定，同时也很大程度上受到表达量的影响。比如目前唯一应用于商品化种植的转玉米突变EPSPS基因转化体GA21，其外源T
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DNA中包含3个完整的表达框(Feng P C C et al.2010，pp.45
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66.Hoboken,NJ:John Wiley&Sons,Inc.)。因此，通过改进和优化获得一种稳定高效表达植物源耐除草剂突变基因的表达载体，对利用植物源耐除草剂基因来获得抗除草剂作物非常迫切。
[0009]通常，由于长期大量单一不合理使用除草剂，导致除草剂的防除效果显著下降，同时也造成抗性杂草的发生。除草剂的抗性问题已成为全球面临的挑战。杂草的抗药性产生，是一些耐药性的杂草或具有抗药性的遗传类型被保留，并能繁殖形成一个较大的种群。目前，有效应对杂草抗性发生的方法主要包括高剂量策略和不同杀草机理的除草剂复配策略。上述策略，一方面是要求转基因耐除草剂植物中目的基因具有较高的表达量，可以耐受较高水平的除草剂；另一方面是要求转入不同除草剂抗性的基因，赋予植物多种除草剂抗性。因此，研发一种同时高效表达两种耐除草剂基因的载体及其转基因植物对研发新一代转基因耐除草剂作物及其杂草抗性治理非常迫切。
(三)
技术实现思路

[0010]本专利技术目的在于提供一种同时稳定高效表达两种植物源耐除草剂突变基因的载体，及其在制备抗除草剂植物细胞、抗除草剂植物方面的应用。
[0011]本专利技术采用的技术方案是：
[0012]本专利技术提供一种同时稳定高效表达两种植物源耐除草剂突变基因的载体T
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DNA，所述载体包含5
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烯醇丙酮酸莽草酸3
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磷酸合酶(EPSPS)突变基因和乙酰乳酸合成酶(ALS)突变基因；所述EPSPS突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1或SEQ ID No：3所示；所述ALS突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No：5或SEQ ID No：7所示。
[0013]进一步，本专利技术所述的EPSPS突变基因为水稻EPSPS突变基因OsEPSPS
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T，其核苷酸
序列为SEQ ID No：1所示，氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。所述的EPSPS突变基因为玉米EPSPS突变基因ZmEPSPS
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T，其核苷酸序列为SEQ ID No：3所示，氨基酸序列如SEQ ID No：4所示。本专利技术所述的ALS突变基因为水稻ALS突变基因OsALS
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T1，其核苷酸序列为SEQ ID No：5所示，氨基酸序列如SEQ ID No：6所示；所述的ALS突变基因为水稻ALS突变基因OsALS
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T2，其核苷酸序列为SEQ ID No：7所示，氨基酸序列如SEQ ID No：8所示。
[0014]本专利技术所述的植物源耐除草剂突变基因是本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时表达两种植物源耐除草剂突变基因的载体，其特征在于所述载体包含5
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烯醇丙酮酸莽草酸3
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磷酸合酶EPSPS突变基因和乙酰乳酸合成酶ALS突变基因；所述EPSPS突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1或SEQ ID No：3所示；所述ALS突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No：5或SEQ ID No：7所示。2.如权利要求1所述的载体，其特征在于所述载体还包括介导植物源耐除草剂突变基因表达的启动子，所述启动子包括植物泛素启动子。3.如权利要求2所述的载体，其特征在于所述植物泛素启动子核苷酸序列如SEQ ID No：9或SEQ ID No：10所示。4.如权利要求1所述的载体，其特征在于所述载体包括终止植物源耐除草剂突变基因表达的终止子，所述终止子包括水稻HSP17.9基因终止子ter1或拟南芥HSP18.2终止子ter2。5.如权利要求4所述的载体，其特征在于所述终止子ter1的核苷酸序列如SEQ ID No：11，终止子ter2的核苷酸序列如SEQ ID No：12所示。6.如权利要求1所述的载体，其特征在于所述载体包括增强植物源耐除草剂突变基因表达量或者稳定性的调控元件，所述调控元件为基质附着区序列MAR，所述基质附着区序列MAR核苷酸序列为SEQ ID No：13所示。7.如权利要求1所述的载体，其特征在于所述载体的基础载体是将pCambia1300载体中的CaMV...

【专利技术属性】
技术研发人员：王东芳，张意红，
申请(专利权)人：杭州芳韵生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：