一种非组培依赖的发根农杆菌介导闽楠遗传转化方法技术

本发明专利技术公开一种非组培依赖的发根农杆菌介导闽楠遗传转化方法，该方法包括如下步骤：(1)闽楠种子处理(2)闽楠种子的萌发和幼苗的培养(3)侵染液的制备(4)侵染(5)共培养(6)毛状根的诱导培养(7)转基因根的检测(8)复合型转基因株系的获得。本发明专利技术建立了稳定高效的闽楠遗传转化体系，获得含转基因根的复合型转基因株系，且该体系转化效率高，成功突破了闽楠转化难的技术障碍，为可用于育种资源的转基因复合植株及完整转基因植株的获得，及闽楠基因功能、次生代谢产物和转基因复合植株及完整转基因植株等方面的研究提供了技术支持。基因植株等方面的研究提供了技术支持。基因植株等方面的研究提供了技术支持。

【技术实现步骤摘要】
一种非组培依赖的发根农杆菌介导闽楠遗传转化方法


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种非组培依赖的发根农杆菌介导闽楠遗传转化方法。

技术介绍

[0002]闽楠是国家二级珍稀渐危种，属于我国重要的珍贵用材树种。其材质坚韧，是上等建筑和家具的优良木材原料，其树体高大通直，枝叶繁茂，可作为园林绿化物种。由于气候环境的变化和人为砍伐等因素，闽楠的现存资源少，仅在江西、福建、浙江、广东、广西、湖南、湖北和贵州呈零星分布。
[0003]随着国家对珍贵用材树种栽培推广的重视，楠木类植物的品种改良显得越来越重要。而品种改良的基础是楠木重要性状相关的遗传基础研究。目前，闽楠基因组测序已经完成，作为一种我国特有的珍贵用材树种，闽楠的研究也开始迈入分子生物学水平。但其目前还没有遗传转化体系建立的报道。大大限制了对楠木重要性状相关的遗传基础研究。因此，建立一套闽楠稳定的转化体系，对于楠木的遗传研究和育种工作的推进已经成了非常急迫的问题。
[0004]发根农杆菌是一类宿主范围广泛的革兰氏阴性菌，属根瘤菌科农杆菌属，其含有的Ri质粒能够侵染众多植物，诱导植物产生高度分支的不定根，也称毛状根。其中Ri质粒上的T
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DNA能在植物基因组中插入、整合并表达，从而诱导植物形成转基因毛状根。发根农杆菌诱导产生的毛状根具有生长速度快，生理生化和遗传性稳定等优点，遗传转化后的毛状根可以进行植物基因功能和次生代谢等方面的研究，甚至可以在发根基础上进行植株再生，获得完整转基因植株，培育和创制植物新种质。r/>[0005]目前发根农杆菌介导的植物转基因大多是利用组培的无菌苗，以无菌苗的叶片或者茎段作为外植体与菌液共培养得到转基因植物，过程繁琐，植物组织培养过程需要比较多的时间和精力。非组培依赖的侵染方法操作更加简便，非组培依赖的发根农杆菌诱导毛状根的侵染方法大致可分为两种：菌液侵染法和注射菌液法。
[0006]发根农杆菌介导的转基因应用于草本植物比较多，由于木本植物的遗传背景复杂，在木本植物的应用存在较大难度。其次木本植物产生的次生代谢物比较多，容易产生褐化，导致转化效率低。再者转化的方法、侵染的具体技术条件和幼苗培养的不够优化都是转化率低的原因。如：枣的转化率仅为9.4％
[1]，茶树的转化率为23.96％
[2]，光皮桦叶片的转化率为36.4％
[3]，橡胶茎段的转化率为36.6％
[4]。以上木本植物转基因株系依赖于组培技术。非组培依赖的转化有：环割法侵染薄壳山核桃的转化率为45.2％
[5]。注射法侵染木豆的转化率约为39％
[6]。非组培依赖的侵染方式转化率比组培方式稍高，但是以上体系的转化率均未超过50％，转化效率比较低。
[0007]本专利技术通过对发根农杆菌菌种，苗龄，侵染菌液浓度，幼苗培养条件及转化后培养条件的筛选和优化，建立了一套非组培依赖的发根农杆菌介导的转化效率高、遗传稳定的闽楠毛状根遗传转化体系，获得了正常生长、遗传稳定的闽楠转基因复合植株，即根部诱导
的发根为转基因器官，而茎叶等地上部器官为非转基因器官。而且复合植株的生长不需要组培体系中所需的移苗、炼苗等复杂、费时且对植株生长有重要影响的程序。转化植株侵染、共培养后，即可按正常植株的生长管理方式进行管理。大大减少了时间和资源成本的投入。方便了闽楠发根的科学研究和生产前景。该转基因体系的建立，不仅有利于深入研究涉及闽楠根发育及营养吸收相关的关键基因功能，有助于闽楠的辅助育种设计和遗传改良，而且基于毛状根具有完整的代谢通路，也为研究闽楠代谢产物和通路提供了新途径。
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技术实现思路

[0014]本专利技术的目的在于攻克闽楠遗传转化难的技术瓶颈，提供一种非组培依赖的发根农杆菌介导闽楠遗传转化方法，获得复合型转基因植株，为闽楠的分子生物研究提供一个有效的平台，同时可以利用其创制对生产有意义的转基因复合植株，用于闽楠育种工作的推进。另外，本专利技术通过对转化过程和幼苗管理等条件方法的优化，大大提高了发根农杆菌的转化效率，转化率达70％以上，高于绝大部分遗传转化体系的转化效率。
[0015]本专利技术提供了一种利用闽楠种子苗的茎为受体，通过发根农杆菌侵染，诱导转基因毛状根，建立闽楠遗传转化体系的方法。包括以下步骤：
[0016](1)闽楠种子预处理：
[0017]将成熟的闽楠果实收获后，去掉果皮，将种子清洗干净，阳光下晾晒至表面无水分附着，然后将种子低温沙藏处理；
[0018](2)播种与育苗：
[0019]将低温沙藏处理的种子播于湿沙中发芽生长至1
‑
3片叶，得到所需闽楠幼苗；其中闽楠育苗阶段发芽后采用温度26℃/22℃(昼/夜)，光照16h/黑暗8h，光照强度为30
‑
50μmol
·
m
‑2·
s
‑1，覆盖保鲜膜保湿，湿度为70％
‑
85％；
[0020](3)侵染：
[0021]用发根农杆菌对闽楠幼苗进行侵染，侵染后把幼苗移栽入已充分吸水的基质中，侵染部位被基质覆盖；其中侵染菌液浓度OD
600
为0.4
‑
1.2，发根农杆菌菌种为K599,C58C1或MSU440；
[0022](4)共培养
[0023]将上述侵染后闽楠幼苗黑暗条件下共培养1
‑
3天；共培养条件是26℃/22℃(昼/夜)，并加盖保湿透明塑料罩进行全程保湿，湿度为70％
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非组培依赖的发根农杆菌介导闽楠遗传转化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)闽楠种子预处理：将成熟的闽楠果实收获后，去掉果皮，将种子清洗干净，阳光下晾晒至表面无水分附着，然后将种子低温沙藏处理；(2)播种与育苗：将低温沙藏处理的种子播于湿沙中发芽生长至1
‑
3片叶，得到所需闽楠幼苗；其中闽楠育苗阶段发芽后采用温度26℃/22℃(昼/夜)，光照16h/黑暗8h，光照强度为30
‑
50μmol
·
m
‑2·
s
‑1，覆盖保鲜膜保湿，湿度为70％
‑
85％；(3)侵染：用发根农杆菌对闽楠幼苗进行侵染，侵染后把幼苗移栽入已充分吸水的基质中，侵染部位被基质覆盖；其中侵染菌液浓度OD
600
为0.4
‑
1.2，发根农杆菌菌种为K599,C58C1或MSU440；(4)共培养将上述侵染后闽楠幼苗黑暗条件下共培养1
‑
3天；共培养条件是26℃/22℃(昼/夜)，并加盖保湿透明塑料罩进行全程保湿，湿度为70％
‑
85％；(5)毛状根诱导培养，获得转化成功的阳性闽楠植株：将共培养后的闽楠幼苗进行毛状根的诱导培养，诱导培养的条件是：温度26℃/22℃(昼/夜)，光照16h/黑暗8h，光照强度为30
‑
50μmol
·
m
‑2·
s
‑1；诱导期间全程保湿，湿度为70％
‑
85％；培养一周后，打开罩子的通气孔；开始毛状根诱导时，每周浇灌促根营养液一次，浇灌三周，所述促根营养液为在1/4Hoagland营养液内添加NAA，使得NAA终浓度为0.05
‑
0.1mg/L；(6)复合型转基因植株培养。...

【专利技术属性】
技术研发人员：程龙军，吴梦洁，洪家都，李芳燕，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：