一种抗虫基因和耐草甘膦基因表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗虫基因和耐草甘膦基因表达载体及其应用，所述表达载体含有抗虫基因cry1Ab、抗虫基因cry2Ae和耐草甘膦基因cp4。本发明专利技术在cry2Ae基因前面加了叶绿体信号肽序列，一方面增加了Cry2Ae蛋白的表达量，增加幅度为20％

【技术实现步骤摘要】
一种抗虫基因和耐草甘膦基因表达载体及其应用
(一)

[0001]本专利技术属于转基因植物新品种培育领域，具体涉及同时高效表达两种抗虫基因和一种耐草甘膦基因的表达载体及其在培育抗虫耐草甘膦的植物细胞、植物方面的应用。
(二)
技术介绍

[0002]全球人口迅速增长带动了粮食需求的大量增加。事实上，通过常规的品种改良和栽培技术改进，特别是杀虫剂的使用，粮食生产在过去几十年已经明显提高。上世纪60年代兴起的细胞遗传学和细胞生物学技术引发了“绿色革命”，使粮食作物的产量显著提高、抗病性和抗虫性明显增强。然而，这些技术的广泛采用也同时给环境和人类健康带来一些新的问题，如农药和化肥的使用导致土壤侵蚀加剧。同时，在这些技术使用20年后，对粮食增产的贡献也明显减少。为克服这些问题，来自于政府、大学、研究机构及公司的科学家们正在寻求新的技术和方法。随着DNA技术的迅速发展，到上世纪80年代科学家们已经开发出一些新的现代育种技术和方法，其中利用农杆菌介导转化和基因枪转化的转基因技术是最为成功的一项。
[0003]随着生物技术的发展以及各国对生物
投入的加大，使得全球育种家和生物技术研究机构能够突破传统的育种框架和育种年限来培育新的植物品种。1995年美国批准了转基因抗虫棉的商业化种植批准，1996年转基因抗虫棉开始推广，中国也在1996年开始引入转基因抗虫棉。2019年
‑
2021年，我国陆续首次审批了抗虫耐除草剂玉米和大豆的农业转基因生物安全证书，标志着我国转基因生物育种技术进入加速期。另外，草地贪夜蛾作为一种杂食性害虫已经于2018
‑
2019年从云南入侵我国，这种害虫危害性大、耐药性强，目前已经对我国的玉米等作物造成严重危害，通过生物育种的方法来防治草地贪夜蛾等害虫迫在眉睫。
[0004]苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是一种常见的革兰氏阳性土壤微生物，它能产生一种对特定生物具有高度选择性的杀虫蛋白。对Bt蛋白已进行了数十年安全性试验证实，它对人类和动物不具毒性。cry1Ab基因是从苏云金芽孢杆菌HD
‑
1菌株克隆得到的，其表达产物Cry1Ab蛋白在鳞翅目害虫中具有广谱的杀虫活性(Hfte H and Whiteley H R.Microbiological Reviews,1989,53(2):242
‑
255.；van Frankenhuyzen K.J Invertebr Pathol.2009,101(1):1
‑
16)。截至2012年1月，共有近70种Cry2蛋白被鉴定出来，涵盖了从Cry2Aa至Cry2Ai共9小类，并以Cry2Ae类占绝大多数，Cry2Ae蛋白仅对鳞翅目昆虫有毒杀作用，且Cry2Ae对美洲棉铃虫的毒力要高于Cry2Aa(Zheng A et al.Ann.Microbiol.2010,60(1):129
‑
134)。虽然Cry2蛋白分子量比Cry1小，但相对Cry1毒素而言，Cry2对鳞翅目的杀虫范围更广，与Cry1之间存在不对称交叉抗性，在农业害虫防治方面具有更大的应用前景。近年来，以转cry2Ae单价基因或cry2Ae+cry1Ac双价基因为主的第二代转基因植物正逐渐取代以转cry1A类基因为主的第一代转基因植物以缓和目标害虫对抗虫植物的适应以及抗性风险等问题，如转基因棉花Bollgard II(Tabashnik B E et al.Appl.Environ.Microbiol.2002,68(8):3790
‑
3794.)。Cry1Ab与Cry2Ae蛋白功能区域的
氨基酸相似度极低，仅为17.9％。因此，二者的杀虫谱差异很大，也不容易产生交付抗性，非常适合联合使用。
[0005]杂草是影响农作物生产的第二大重要因素。它与农作物竞争水资源、肥料、光源等，造成农作物的产量降低，同时还会降低农产品的品质。传统的手工除草方法费时费力并且效率很低，机械除草费用较高，而化学药剂除草对技术要求较高并且极易对植物造成药害，影响作物本身的生长发育，同时化学药剂还可能会影响到邻近敏感的农作物。
[0006]目前，通过转基因的方法让植物耐受草甘膦是应用最广泛的杂草解决方案。草甘膦，化学名称为N
‑
(磷酸甲基)甘氨酸，是一种有机膦类除草剂，是一种内吸传导型广谱灭生性除草剂，拥有40多年的长期安全使用记录。可以通过在植物中表达CP4(来源于农杆菌CP4菌株，编码CP4EPSPS蛋白)(Padgette,S R et al.1996.Pages 53
‑
84in Herbicide
‑
Resistant Crops)等EPSPS基因和Gat(来源于土壤微生物宏基因组的草甘磷N
‑
乙酰转移酶的基因)等能表达降解草甘膦的酶的基因赋予植物耐草甘膦的性状。
[0007]让植物同时表达多种目的蛋白的方法主要包括多表达框分子克隆堆积法、杂交堆积法、基因融合法，其中多表达框分子克隆堆积法以其具备的稳定性好、可预见性强和后期植物转育容易等优势被广泛使用。而多表达框堆积策略的效果受诸多因素的影响，包括基因的选择、编码序列的选择、每个表达框包括启动子、终止子等在内的调控元件的选择、各读码框的排列等。这些因素都会对目的基因的表达水平、表达模式已经不同代次间的稳定性特别是高代次的基因沉默情况有不同的影响。因此一个能高效稳定的表达多个目的基因的表达载体需要经过严格的探索与测试，而这种载体对获得稳定高效的转基因作物起到决定性作用。
(三)
技术实现思路

[0008]本专利技术目的是提供一种同时稳定高效表达抗虫基因(cry1Ab、cry2Ae)和耐草甘膦基因(cp4基因)的双元载体，及其在制备抗虫耐草甘膦植物细胞、农作物方面的应用，使相应的转基因作物具有更广的杀虫谱，同时延缓昆虫对杀虫蛋白产生抗性，且同时耐草甘膦。
[0009]本专利技术采用的技术方案是：
[0010]本专利技术提供一种同时稳定高效表达抗虫基因和耐除草剂草甘膦基因的表达载体，所述的表达载体含有抗虫基因cry1Ab、抗虫基因cry2Ae和耐草甘膦基因cp4。
[0011]进一步，本专利技术所述抗虫基因cry1Ab编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示，其核苷酸序列经过密码子优化，序列为SEQ ID No：1所示；本专利技术所述抗虫基因cry2Ae编码的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示，其核苷酸序列经过密码子优化，序列为SEQ ID No：3所示；本专利技术所述耐草甘膦基因cp4编码的氨基酸序列如SEQ ID No：6所示，其核苷酸序列经过密码子优化，序列为SEQ ID No：5所示。
[0012]SEQ ID No：1cry1Ab基因
[0013]atggacaacaacccgaacatcaacgagtgcatcccgtacaactgcctctccaacccggaggtggaggtgctcggcggcgag本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗虫基因和耐草甘膦基因的表达载体，其特征在于所述表达载体含有抗虫基因cry1Ab、抗虫基因cry2Ae和耐草甘膦基因cp4。2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述抗虫基因cry1Ab核苷酸序列为SEQ ID No：1所示；所述抗虫基因cry2Ae核苷酸序列为SEQ ID No：3所示；所述耐草甘膦基因cp4核苷酸序列为SEQ ID No：5所示。3.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述表达载体包含玉米泛素启动子pZmUbi或复合启动子；所述复合启动子由CaMV35S启动子与玉米actin2的第二个内含子组成。4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述玉米泛素启动子pZmUbi核苷酸序列如SEQ ID No：11所示；所述复合启动子核苷酸序列如SEQ ID No：7所示。5.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述表达载体包含根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子Tnos或CaMV35S终止子T35S。6.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述表达载体包括玉米EPSPS基因的叶绿体信号肽或水稻EPSPS基因的叶绿体信号肽；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王东芳，张意红，
申请(专利权)人：杭州芳韵生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：