黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7及其在增加活性氧及抑制茉莉酸信号通路中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7及其在增加活性氧及抑制茉莉酸信号通路中的应用。本发明专利技术黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7的编码区序列如SEQ NO.1所示，黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7序列中的ALWL结构域和CCMC酶活性位点用于抑制茉莉酸信号通路；过表达转基因植株负调控对灰霉病的抗性。本发明专利技术将植物中所述基因CsGRX7进行过表达使植物的活性氧更容易激发，茉莉酸信号通路受抑制而对病害更易感，在田间栽培可将其作为易感的标记植物，及时对其进行病害感染的田间观察，根据其病害进程及时进行病害防治；相应的，若进行降低该基因的表达使植物获得较强的抗性，并进行抗病种质培育的应用。育的应用。育的应用。

【技术实现步骤摘要】
黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7及其在增加活性氧及抑制茉莉酸信号通路中的应用


[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，具体涉及一种黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7及其在增加活性氧及抑制茉莉酸信号通路中的应用。

技术介绍

[0002]灰霉病由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起，常常由幼嫩的开花部位进行侵染，尤其是环境湿度大时病原菌累积，导致幼果从开花的部位感病，从而造成化瓜。黄瓜(Cucumis sativus L.)作为一种喜温类蔬菜，由于其喜温怕寒的特性，多在设施中进行栽培，但设施中较高的湿度和温度极易造成灰霉病的发生与蔓延，且连年种植也极易引起病原菌的积累，从而造成严重的连作障碍。
[0003]随着设施黄瓜栽培的快速发展和栽培面积的扩大，低温高湿的环境条件使灰霉病的发生越来越严重。在对灰霉病等真菌性病害的反应中，一些关键的调控基因在应对病原菌侵染和防御反应中起非常重要的作用，在病原菌侵染过程中，它们通过调控关键基因编码的蛋白氧化还原状态的改变、活性氧的诱导以及关键信号通路的调节等，积极参与对病害的防御反应，使植物表现为对病害敏感或者抗病。尤其通过对病害的防御反应，使植株对病原菌的侵染表现出敏感反应，诱导植物的防御反应或者启动相应基因的表达，从而正调控或者负调控病原菌侵染进程。因此，挖掘植物关键的调控基因，通过解析调控基因的功能从而明晰病原菌对植物的致病机理，对病原菌的侵染进行防御非常重要。
[0004]目前生产上灰霉病主要集中在幼嫩的开花部位进行侵染，环境湿度大时幼果易感病，从而造成化瓜。在发病初期，由于病害发病部位在开花部位，尤其是湿度大的时候容易发病，症状隐藏，难以观察，等病害进程加快造成化瓜时，再进行防治就会太晚。因此，随着人们对病害潜在机制了解的日益深入，利用易感植株作为标记植物对病害及时进行观察，或者利用基因敲除技术敲除易感基因降低其表达水平，培育灰霉病抗病种质。黄瓜灰霉病的抗病育种研究及品种创制进展较为缓慢，因此，明确黄瓜对灰霉病抗性反应的机理，提高和改良黄瓜灰霉病的抗病性，对黄瓜抗病种质创制具有重要的理论和实践意义。
[0005]近年来，越来越多的证据表明植物CC型谷氧还蛋白基因对植物氧化还原调节及信号通路的调控方面发挥了重要作用。谷氧还蛋白(GRX)是广泛存在于原核和真核生物一类小分子蛋白，可通过巯基(
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SH
‑
)与二硫键(
‑
S
‑
S
‑
)形式之间的交换来参与机体在各种环境下复杂的蛋白质氧化修复和调节过程，从而实现对蛋白功能的调控。CC型是陆生植物中所特有的一类谷氧还蛋白，具有多种生物学功能，如参与氧化应激及细胞凋亡、花器官发育、响应干旱及盐等非生物胁迫，以及植物抗病反应等。但黄瓜中的CC型谷氧还蛋白如何参与黄瓜防御灰霉病等问题人们还不甚明了，关于它在参与调控相应的信号通路中的作用还不清楚，因此，研究黄瓜谷氧还蛋白基因在灰霉胁迫下是如何发挥作用的，其关键结构域对于信号通路调控的作用等，有助于人们明确谷氧还蛋白参与的氧化还原调控机制，能够进一步了解黄瓜在抵御灰霉侵染进程中的信号转导机制，从而为黄瓜的病虫害防治及抗病育种
等研究奠定基础。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供一种黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7及其在增加活性氧及抑制茉莉酸信号通路中的应用，将植物中所述基因CsGRX7进行过表达使植物的活性氧更容易激发，茉莉酸信号通路受抑制而对病害更易感，在田间栽培可将其作为易感的标记植物，及时对其进行病害感染的田间观察，根据其病害进程及时进行病害防治；相应的，若进行降低该基因的表达使植物获得较强的抗性，并进行抗病种质培育的应用。
[0007]为解决现有技术存在的问题，本专利技术的技术方案是：黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7，其特征在于：该基因的编码区序列如SEQ NO.1所示。
[0008]黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7在增加活性氧及抑制茉莉酸信号通路中的应用。
[0009]进一步，黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7在过表达植株中通过增加活性氧的累积，抑制茉莉酸信号通路。
[0010]进一步，黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7序列中的ALWL结构域和CCMC酶活性位点用于抑制茉莉酸信号通路；过表达转基因植株负调控对灰霉病的抗性。
[0011]进一步，转基因植株为拟南芥。
[0012]与现有技术相比，本专利技术的优点如下：
[0013]1)本专利技术黄瓜CC型谷氧还蛋白CsGRX7的氨基酸序列具备CCMS酶活性位点和C末端ALWL结构域；参与了灰霉菌侵染条件下活性氧的积累。
[0014]2)本专利技术黄瓜CC型谷氧还蛋白CsGRX7参与了茉莉酸JA信号通路的抑制，其中CsGRX7氨基酸序列中ALWL结构域和CCMC活性位点是抑制JA信号通路必需的。黄瓜谷氧还蛋白基因过表达能明显负调控对灰霉菌的抗性。在定量接种灰霉孢子悬浮液后，CsGRX7过表达拟南芥叶片病斑面积显著大于野生型。上述结果表明黄瓜CC型谷氧还蛋白基因CsGRX7负调控植株对灰霉菌的抗性反应。
附图说明
[0015]图1为CsGRX7氨基酸序列的酶活性位点和氨基酸末端的保守结构域及对酶活性位点和末端保守结构域的突变。其中，A：CsGRX7氨基酸序列的酶活性位点和氨基酸末端的保守结构域；B：CsGRX7酶活性位点和末端保守结构域突变前后的氨基酸序列比对；C：对构建的植物表达载体pB2HA
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CsGRX7SSMS及pB2HA
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CsGRX7ALWA酶切检测；其中M泳道为DL2000Marker；a泳道为pB2HACsGRX7SSMS酶切检测；b泳道为pB2HACsGRX7ALWA酶切检测。
[0016]图2为CsGRX7瞬时表达对华北型黄瓜No.26活性氧爆发的影响。其中，A：CsGRX7在黄瓜子叶中的表达情况；B：flg22诱导后不同处理对活性氧含量爆发的影响；C：定量测定flg22诱导后不同处理的活性氧曲线下面积。
[0017]图3黄瓜CsGRX7基因的原生质体瞬时转化对LUC酶活性的影响，其酶活性的高低可以反映茉莉酸JA信号通路的标记基因PDF1.2的表达水平。
[0018]图中：在原生质体瞬时表达体系中荧光素酶作为ORA59转录因子的报告基因，而EIN3(ethylene insensitive 3)作为激发子，其表达可激发ORA59的表达，其酶活性的高低可以反映ORA59的表达水平。其中CsGRX7 ALWA是代表将CsGRX7的结构域ALWL突变为ALWA；
CsGRX7 CCMS将CCMC活性中心位点突变为SSMS，以观察上述位点突变对JA信号通路的影响。
[0019]图4为突变体、野生型(WT)和转基因株系灰霉菌侵染后病斑情况。其中，A为突变体、野生型(WT)和转基因株系OE3、OE4和OE6在灰霉菌侵染下病斑情况；B为突变体、野生型(WT)和转基因株系OE3、OE4和OE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7，其特征在于：该基因的编码区序列如SEQ NO.1所示。2.黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7在增加活性氧及抑制茉莉酸信号通路中的应用。3.如权利要求2所述的黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7在增加活性氧及抑制茉莉酸信号通路中的应用，其特征在于，黄瓜谷氧还蛋白基因CsGRX7在过表达植株中通过增加活性氧的累积，抑制茉莉酸信号通路。4.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈书霞，陈盼盼，杨玉婷，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：