外源基因导入绞股蓝的方法技术

本发明专利技术公开了外源基因导入绞股蓝的方法，包括：S1：选取采收后3个月内、带种皮的绞股蓝种子，消毒，培养获得种子实生无菌组培苗，或者选取去除叶片的带腋芽茎段，消毒，利用继代增殖培养基培养获得扦插无菌组培苗，继代增殖培养基内包括头孢霉素；S2：选取S1得到的种子实生无菌组培苗或扦插无菌组培苗，在生根培养基内培养，得到无菌生根苗，生根培养基内包括头孢霉素；S3：将质粒Pcambia1301

【技术实现步骤摘要】
外源基因导入绞股蓝的方法


[0001]本专利技术涉及植物转基因
更具体地说，本专利技术涉及外源基因导入绞股蓝的方法。

技术介绍

[0002]绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino)，属葫芦科(Cucurbitaceae)绞股蓝属(Gynostemma)多年生草质攀援藤本植物。绞股蓝是目前发现除五加科外还具有人参皂苷结构的少数植物来源之一，具有滋补保健、抗癌防衰、增强体质和改善脂质代谢等多种功能，号称“南方人参”和“不老长寿药草”。人参是一种被广泛应用的草本植物，具有抗疲劳、延缓衰老、调节中枢神经系统、提高机体免疫力、改善心脑血管供血不足、抑制肿瘤细胞生长等作用，它的药效成分大部分来自于达玛烷型四环三萜。能够生产达玛烷型皂苷的植物主要集中于人参属，如人参、三七和西洋参，但是它们生产周期一般为3
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5年，轮作周期至少10年。如何获得大量的达玛烷型皂苷及其次生苷和苷元成为现代药学研究的重点。而绞股蓝本身具有完整的达玛烷型皂苷合成途径，所有绞股蓝皂苷的苷元部分都为达玛烷型四环三萜类；同时绞股蓝易生长，且不存在人参科植物普遍存在的连作障碍，具备作为生物反应器来合成达玛烷型皂苷的巨大潜力，而建立高效的遗传转化体系是构建生物反应器的必要工作环节。
[0003]但是，在绞股蓝中导入外源基因难度较大，现有技术中多次报道导入失败，例如广西医科大学的硕士学位论文“三七SE基因克隆及转化烟草、绞股蓝的初步研究”在尝试了多种菌液浸泡时间、多种抗生素浓度后，仍未实现绞股蓝基因转化。专利技术人在对该文献进行重新性试验后，发现确实无法转化，因此在进行大量试验后，专利技术人将研究起点提前至种子采收环节和外植体选择，并发现种子发芽参数、外植体诱导参数、生根参数、头孢霉素浓度、甘露糖浓度对导入是否成功均具有关键影响，经过调整，终于实现了外源基因导入。

技术实现思路

[0004]本专利技术的一个目的是提供一种外源基因导入绞股蓝的方法，能够成功将外源基因导入绞股蓝，得到绞股蓝阳性植株。
[0005]为了实现本专利技术的这些目的和其它优点，本专利技术提供了外源基因导入绞股蓝的方法，包括：S1：选取采收后3个月内、带种皮的绞股蓝种子，消毒，培养获得种子实生无菌组培苗，或者选取去除叶片的带腋芽茎段，消毒，利用继代增殖培养基培养获得扦插无菌组培苗，所述继代增殖培养基内包括头孢霉素；S2：选取S1得到的种子实生无菌组培苗或扦插无菌组培苗，在生根培养基内培养，得到无菌生根苗，所述生根培养基内包括头孢霉素；S3：将质粒Pcambia1301
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PMI转入农杆菌内，并在含有卡那霉素和利福平的培养基中培养，培养获得农杆菌重悬液；S4：利用所述农杆菌重悬液侵染S2得到的无菌生根苗，并进行共培养、抑菌培养和筛选培养，得到转基因不定芽。
[0006]进一步地，在S1中，对采收后3个月内的种子或去除叶片的带腋芽茎段进行消毒的
方法包括：依次用浓度为75％的酒精和浓度为0.1％氯化汞水溶液浸泡。
[0007]进一步地，在S1中，将消毒后的种子利用诱导培养基进行培养得到种子实生无菌组培苗，所述诱导培养基包括MS培养基、蔗糖和琼脂，每升MS培养基包含蔗糖28g、琼脂5.5g；将消毒后的种子7天24h暗培养，之后以光培养：暗培养＝12h:12h的光照条件培养，光照强度为2000～2500Lux。
[0008]进一步地，在S1中，所述继代增殖培养基包括MS培养基、蔗糖、琼脂、6
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苄基腺嘌呤、α
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萘乙酸和头孢霉素，每升MS培养基包含蔗糖28g、琼脂5.5g、6
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苄基腺嘌呤1.5mg、α
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萘乙酸0.02mg、头孢霉素30～200mg。
[0009]进一步地，在S2中，所述生根培养基包括1/2MS培养基、蔗糖、琼脂、吲哚乙酸和头孢霉素，每升1/2MS培养基中包含蔗糖28g、琼脂5.5g、吲哚乙酸0.2mg、头孢霉素30～200mg。
[0010]进一步地，在S3中，将含有pCAMBIA1301
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PMI农杆菌生长在含有50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的YEP固体培养基上，培养时长为28～48h，挑单菌落，并将单菌落置于含有50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的YEP液体培养基上振荡培养，至OD值为0.8～1.0取出，离心，收集菌体，震荡培养至其OD值达到0.4～0.6，获得农杆菌重悬液。
[0011]进一步地，共培养培养基包括MS培养基、蔗糖、琼脂、6
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苄基腺嘌呤、α
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萘乙酸，其中，每升MS培养基中含蔗糖28g、琼脂5.5g、6
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苄基腺嘌呤1.5mg、α
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萘乙酸0.02mg，在黑暗条件下共培养2～4天。
[0012]进一步地，抑菌培养培养基包括MS培养基、蔗糖、琼脂、6
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苄基腺嘌呤、α
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萘乙酸和头孢霉素，每升MS培养基中含蔗糖28g、琼脂5.5g、6
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苄基腺嘌呤1.5mg、α
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萘乙酸0.02mg，头孢霉素30～200mg，在光照条件下抑菌培养5天。
[0013]进一步地，筛选培养基包括MS培养基、蔗糖、琼脂、6
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苄基腺嘌呤、α
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萘乙酸和头孢霉素，其中，每升MS培养基中含蔗糖28g、琼脂5.5g、6
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苄基腺嘌呤1.5mg、α
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萘乙酸0.02mg、头孢霉素30～200mg，甘露糖：蔗糖＝(3～4)：(24～25)。
[0014]本专利技术至少包括以下有益效果：
[0015]1)本专利技术从绞股蓝种子采收环节和外植体选择开始，通过对种子发芽参数、外植体诱导参数、生根参数、头孢霉素浓度、甘露糖浓度进行调整，不仅能利用绞股蓝的带皮种子作为外植体，成功诱导出绞股蓝无菌组培苗，而且还能以带芽茎段为外植体，成功诱导出无菌组苗，并摸索到合适的芽增殖培养基及生根培养基，成功建立起了绞股蓝的2套组织培养快繁技术体系，为绞股蓝的遗传转化体系的建立奠定了必要的技术基础。
[0016]2)本专利技术利用带腋芽茎段为转基因受体材料，用含有表达载体的农杆菌菌液对其进行侵染，使用6
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磷酸甘露糖异构酶正向选择标记系统；培养周期短，侵染后培养30
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45d后即可进行转化效果检测；总共有288个带腋芽茎段参加侵染实验，最终得到85株植株样品参加DNA检测，其中有59个呈阳性，DNA检测阳性率为69.41％，估算转化率为20.49％；参加氯酚红检测的58个样品中有31个呈阳性，氯酚红检测阳性率为53.45％，估算转化率为10.76％；参加RT
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PCR检测的35个样品中有21个呈阳性，RT
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PCR检测阳性率为60％，估算转化率为7.29％；结果显示，转化效果相对稳定，本专利技术有效本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.外源基因导入绞股蓝的方法，其特征在于，包括：S1：选取采收后3个月内、带种皮的绞股蓝种子，消毒，培养获得种子实生无菌组培苗，或者选取去除叶片的带腋芽茎段，消毒，利用继代增殖培养基培养获得扦插无菌组培苗，所述继代增殖培养基内包括头孢霉素；S2：选取S1得到的种子实生无菌组培苗或扦插无菌组培苗，在生根培养基内培养，得到无菌生根苗，所述生根培养基内包括头孢霉素；S3：将质粒Pcambia1301
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PMI转入农杆菌内，并在含有卡那霉素和利福平的培养基中培养，培养获得农杆菌重悬液；S4：利用所述农杆菌重悬液侵染S2得到的无菌生根苗，并进行共培养、抑菌培养和筛选培养，得到转基因不定芽。2.如权利要求1所述的外源基因导入绞股蓝的方法，其特征在于，在S1中，对采收后3个月内的种子或去除叶片的带腋芽茎段进行消毒的方法包括：依次用浓度为75％的酒精和浓度为0.1％氯化汞水溶液浸泡。3.如权利要求1所述的外源基因导入绞股蓝的方法，其特征在于，在S1中，将消毒后的种子利用诱导培养基进行培养得到种子实生无菌组培苗，所述诱导培养基包括MS培养基、蔗糖和琼脂，每升MS培养基包含蔗糖28g、琼脂5.5g；将消毒后的种子7天24h暗培养，之后以光培养：暗培养＝12h:12h的光照条件培养，光照强度为2000～2500Lux。4.如权利要求1所述的外源基因导入绞股蓝的方法，其特征在于，在S1中，所述继代增殖培养基包括MS培养基、蔗糖、琼脂、6
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苄基腺嘌呤、α
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萘乙酸和头孢霉素，每升MS培养基包含蔗糖28g、琼脂5.5g、6
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苄基腺嘌呤1.5mg、α
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萘乙酸0.02mg、头孢霉素30～200mg。5.如权利要求1所述的外源基因导入绞股蓝的方法，其特征在于，在S2中，所述生根培养基包括1/2MS培养基、蔗糖、琼脂、吲哚乙酸和头孢霉素，每升1/2MS培养基中包含蔗糖28g...

【专利技术属性】
技术研发人员：师凤华，谭木秀，刘凤鸣，
申请(专利权)人：广西壮族自治区药用植物园，
类型：发明
国别省市：