精确提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的方法和一种启动子核心序列及应用技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，涉及作物育种技术领域，具体涉及精确提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的方法和一种启动子核心序列及应用。本方法为对大白果糯的D14基因的启动子区域进行用于降低D14基因的表达水平的基因编辑。直接对独脚金内酯通路关键基因的编码区进行操作会导致水稻分蘖数过高，不利于水稻单株产量的提高。本方案对D14基因的启动子区域进行基因编辑，可以适当降低基因表达量，进而实现对分蘖数的控制。本发明专利技术可以应用于水稻分蘖和产量的精确提高及贵州地方优质水稻的分子育种实践，从而实现对优质稻米分蘖和产量的协同提高，解决贵州地方优质稻分蘖少、产量较低，难以推广种植导致种质资源难以保存的问题。保存的问题。保存的问题。

【技术实现步骤摘要】
精确提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的方法和一种启动子核心序列及应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，涉及作物育种
，具体涉及精确提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的方法和一种启动子核心序列及应用。

技术介绍

[0002]水稻是最重要的粮食作物，中国65％的人口以稻米为主食。分蘖是水稻等单子叶植物基部的特殊分枝，与水稻产量密切有关。一般情况下，粳稻中花11野生型的分蘖数在10
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15个，其分蘖数增加到20
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30个有利于单株产量的提高。粳稻日本晴野生型的分蘖数在20
‑
25个，其分蘖数提高到30
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40个有利于水稻单株产量的提高。这是因为一定数量的水稻分蘖数与单株产量呈正相关，但分蘖过多又会产生无效分蘖，导致产量降低。因此，如何精准增加水稻分蘖数使其保持在合理、有效的范围，提高分蘖较少的水稻的单产，已成为制约水稻品种在农业生产上应用的关键限制因素。
[0003]“大白果糯”是贵州的优质特色种质资源，本方案的实验材料收集于贵州省盘州市旧营乡旧营村，“大白果糯”在贵州兴仁、遵义和黔东南地区也种植较多。“大白果糯”种质资源保存于贵州大学水稻产业技术研究院和云贵高原特色作物省级种质资源圃。其米饭天然清香，口感绵软、粘性适中、适口性好，为米中精品。但“大白果糯”分蘖数较少(4个左右)，导致其单产较低，亩产平均两百多公斤，品质好但产量不高限制了其推广和应用，如何提高“大白果糯”的产量是当下亟待解决的问题。
[0004]大量研究表明独脚金内酯途径调控水稻分蘖的效果非常明显，其合成途径及其信号转导中多个关键基因的编码区突变均导致水稻分蘖数成倍增加。例如：植物激素独脚金内酯(SLs)途径调控水稻分蘖非常明显。独脚金内酯由下向上运输，抑制水稻分蘖芽的伸长，其中D27、D17、D10位于SLs合成途径中，D14、D3和D53位于SLs信号传导途径中。SLs的受体D14基因编码一个水解酶/酯酶，负调控水稻分蘖，日本晴背景的d14突变体分蘖数达到了116个，而日本晴野生型对照分蘖数只有22个。除了d14外，D27、D17、D10、D14、D3、D53和OsTB1/FC1(水稻TCP家族基因，抑制水稻分蘖)对水稻分蘖的调控均非常明显。但过高的分蘖数并不利于水稻单株产量的提高。如果对这些基因的编码区进行敲除，会导致其基因功能完全丧失，使得水稻分蘖数大幅度增加，最终不利于单株产量提高。
[0005]如何协调水稻特别是“大白果糯”的品质和产量，保持水稻相对较高的分蘖数且不改变其品质(即分蘖数适当)，既是提高水稻产量的现实需要，也是农业可持续发展的需要。

技术实现思路

[0006]本专利技术意在提供精确提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的方法，以解决现有技术中的贵州优质特色稻大白果糯分蘖数少以及产量低的技术问题。
[0007]为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]精确提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的方法，对大白果糯的D14基因的
启动子区域进行用于降低D14基因的表达水平的基因编辑。
[0009]本方案还提供了一种精确提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的方法在水稻分子育种中的应用。
[0010]本方案的原理及优点是：
[0011]经研究发现植物激素独脚金内酯调控水稻分蘖的效果非常明显，其合成途径及其信号转导中多个关键基因的编码区突变均导致水稻分蘖数成倍增加，但过高的分蘖数并不利于水稻单株产量的提高。如果对这些基因的编码区进行敲除，会导致其基因功能完全丧失，使得水稻分蘖数大幅度增加，最终不利于单株产量提高。本专利技术利用基因编辑技术在“大白果糯”中对独脚金内酯的受体基因D14基因启动子序列多个区段进行了敲除，发现其ATG上游一个特殊区段敲除后，D14基因表达适度下降，“大白果糯”分蘖数从4个增加到9个左右，单株产量从6g提高到17g左右。本专利技术可以应用于水稻分蘖和产量的精确提高和贵州地方优质稻的分子育种实践中。本专利技术提供了通过适度降低D14基因的表达提高大白果糯分蘖和产量的方法。本专利技术的具体实施例证明通过编辑D14基因的启动子序列，可实现精确提高贵州地方优质稻“大白果糯”的分蘖和产量，方便该品种的推广种植，便于优质种质资源的保存。
[0012]上述方法中，所述基因编辑可采用锌指核酸酶技术(Zinc finger nuclease，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶技术(Transcription activator
‑
like effector nuclease，TALEN)、成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统技术(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated，CRISPR/Cas9系统)，以及其它能实现基因组定点编辑的技术实现的。
[0013]进一步，所述启动子区域的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
[0014]所述D14基因编码的蛋白质为：
[0015]A1：序列如SEQ ID No.3所示的蛋白质；
[0016]或者A2：如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的、与SEQ ID No.3具有80％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
[0017]或者A3：在A1或者A2的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
[0018]上述方法中，序列表中的SEQ ID No.3由107个氨基酸残基组成。同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Perresidue gap cost和Lambda ratio分别设置为11.1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。所述80％以上的同一性可为至少81％、85％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
[0019]进一步，所述基因编辑采用CRISPR/Cas9系统，其sgRNA的靶序列位于所述启动子区域中，且靶序列的3
’
端连接的序列为NGG；靶序列的长度为19
‑
20bp，N为A、T、G、C中的任意一个核苷酸。基因组编辑具体可借助CRISPR/Cas9系统实现。所述CRISPR/Cas9方法，其靶序列为位于D14基因中任一包括XXXNGG的核苷酸序列上的XXX序列。在所述启动子区域中设计CRISPR/Cas9系统的sgRNA的靶序列，可以有效保证目的基因的表达量适度降低。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.精确提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的方法，其特征在于：对大白果糯的D14基因的启动子区域进行用于降低D14基因的表达水平的基因编辑。2.根据权利要求1所述的精确提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的方法，其特征在于：所述启动子区域的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述D14基因编码的蛋白质为：A1：序列如SEQ ID No.3所示的蛋白质；或者A2：如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的、与SEQ ID No.3具有80％以上的同一性且功能相同的蛋白质；或者A3：在A1或者A2的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。3.根据权利要求2所述的精确提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的方法，其特征在于：所述基因编辑采用CRISPR/Cas9系统，其sgRNA的靶序列位于所述启动子区域中，且靶序列的3
’
端连接的序列为NGG；靶序列的长度为19
‑
20bp，N为A、T、G、C中的任意一个核苷酸。4.根据权利要求3所述的精确提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的方法，其特征在于：所述靶序列位于D14基因的起始密码子上游1176
‑
1154bp的区域以及D14基因的起始密码子上游1026
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【专利技术属性】
技术研发人员：方中明，骆骏，吴博文，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：