一种利用葡萄愈伤组织瞬时转化外源基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用葡萄愈伤组织瞬时转化外源基因的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术首先将葡萄叶片脱分化，诱导其形成愈伤组织，然后以携带GUS基因的农杆菌，利用农杆菌侵染法，在超声处理和真空处理相结合的方式下实现外源DNA片段在葡萄愈伤组织中的瞬时表达。本发明专利技术方法可以将任何基因瞬时转化至葡萄愈伤组织中，时间短，效率高，能在3

【技术实现步骤摘要】
一种利用葡萄愈伤组织瞬时转化外源基因的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是一种利用葡萄愈伤组织瞬时转化外源基因的方法。

技术介绍

[0002]葡萄是世界上重要的经济类果树作物之一，被广泛用于酿酒、鲜食、制汁、制干等，为人类创造了明显的社会效益、生态效益与经济效益。近年来，葡萄基因组测序、重测序以及相关组学等方面的研究取得了较大进展，为理解葡萄基因组的基因构成与表达提供了海量信息，但对于葡萄基因功能的研究仍受葡萄染色体高度杂合、童期长、遗传转化难等因素限制。在功能基因研究中，目前多采用模式植物转化体系，将葡萄基因导入烟草、拟南芥等模式植物，这种研究策略在某种程度上可以对葡萄属植物基因的功能进行注释和研究。然而，多年生葡萄属植物与一年生模式植物的基本生长习性与发育模式明显不同，该策略的应用在葡萄基因功能研究方面具有较大局限性。
[0003]瞬时遗传转化是研究蛋白质定位和基因功能的一种简单而快速的技术，能够进行高通量分析。瞬时表达分析提供了在极短时间内研究较多基因的有效方法。瞬时转化体系的建立能够有效实现在葡萄中快速且高通量基因表达的分析。在20世纪80年代，植物中瞬时基因表达的方法与稳定转化方案同时开发，主要涉及根癌农杆菌介导的转化或通过化学(聚乙二醇，即PEG处理)或物理(粒子轰击)技术进行的直接基因转移。与常用的粒子轰击和原生质体转化相比，农杆菌介导的转化在许多植物物种中使用得更频繁。农杆菌介导的方法，包括稳定转化和瞬时基因表达，已在许多植物物种中发挥作用。这种方法是一种通用的方法，可以在几小时内检测到目标基因的瞬时表达。
[0004]在瞬时转化过程中，农杆菌如何侵入细胞是个很重要的问题。到目前为止，一般采用高压真空泵抽气辅助农杆菌菌液进入细胞中。但高压处理是在破坏细胞膜的情况下将农杆菌菌液侵入植物细胞，长时间的高压处理可以导致植物膜结构大规模的破坏，最终使植物细胞死亡，遗传转化的失败，同时平均转化效率还受到多种因素的影响。尽管在一些葡萄品种中已经成功地实施了稳定和瞬时转化方法，然而，在大多数葡萄品种中仍然存在重大技术障碍。因此，开发一种能够实现葡萄基因的快速、高效瞬时转化体系至关重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种利用葡萄愈伤组织瞬时转化外源基因的方法，以解决现有技术中存在的问题。本专利技术首先诱导葡萄形成愈伤组织，能够在短时间内提供充足的转化材料，然后利用农杆菌在超声后真空处理方式下侵染葡萄愈伤组织，有效缩短了侵染时间。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]本专利技术提供一种利用葡萄愈伤组织瞬时转化外源基因的方法，包括以下步骤：
[0008](1)葡萄愈伤组织的制备：取无菌葡萄叶片，诱导培养3
‑
4周，获得愈伤组织，再经
过增殖培养，获得侵染材料；
[0009](2)侵染菌液的制备：取过表达GUS基因的农杆菌菌株接种于含抗生素的LB液体培养基中恢复培养，然后转移至含抗生素的LB液体培养基中扩大培养，扩大培养的菌液离心后，取沉淀，悬浮再离心，去除上清液，重复2
‑
3次，取最终沉淀后悬浮，获得侵染菌液；
[0010](3)农杆菌对葡萄愈伤组织的侵染：将步骤(1)获得的侵染材料加入到步骤(2)获得的侵染菌液中，超声后真空处理，获得侵染后的愈伤组织；
[0011](4)农杆菌侵染后的培养：取侵染后的愈伤组织，吸干菌液后共培养，共培养后的愈伤组织进行脱菌处理，获得脱菌后的愈伤组织；
[0012]进一步地，在步骤(1)中，所述诱导培养的培养基为3.21g/LB5培养基，0.5mg/LNAA，2.0mg/L6
‑
BA，60g/L蔗糖，0.5g/L活性炭，3.0g/L植物凝胶，pH5.8
‑
5.9；培养条件为25
±
1℃，黑暗培养。
[0013]进一步地，在步骤(1)中，所述增殖培养的培养基为3.21g/LB5培养基，0.05mg/LNAA，0.5mg/L2,4
‑
D，2.0mg/L激动素，60g/L蔗糖，0.5g/L活性炭，3.0g/L植物凝胶，pH5.8
‑
5.9；培养条件为25
±
1℃，黑暗培养。
[0014]进一步地，在步骤(2)中，所述过表达GUS基因的农杆菌菌株为含有重组质粒的EHA105菌株；所述重组质粒由质粒pCAMBIA2301在其GUS基因上游插入35S强启动子构建获得。
[0015]进一步地，在步骤(2)中，取最终沉淀悬浮后，还包括加入100μM乙酰丁香酮。
[0016]进一步地，在步骤(2)中，所述侵染菌液的OD
600
＝0.8。
[0017]进一步地，在步骤(3)中，所述超声处理的频率为100Hz，处理时间为4min；所述真空处理的压强为0.8Mpa，处理时间为5min。
[0018]进一步地，在步骤(4)中，所述共培养的培养基为3.21g/LB5培养基，0.05mg/LNAA，0.5mg/L2,4
‑
D，2.0mg/L激动素，100μmol乙酰丁香酮，60g/L蔗糖，0.5g/L活性炭，3.0g/L植物凝胶，pH5.8
‑
5.9；培养条件为25℃，黑暗培养，培养时间为1d。
[0019]本专利技术还提供一种根据所述方法制备的转基因愈伤组织。
[0020]本专利技术公开了以下技术效果：
[0021]1、本专利技术采用葡萄愈伤组织作为侵染材料，没有蜡质层的保护，较叶片、叶柄、茎段和种子等其他材料更容易侵染。
[0022]2、本专利技术利用农杆菌侵染法，将葡萄愈伤组织加入侵染菌液中，采用超声处理4分钟后，再用真空泵抽真空5分钟，两种方式的结合使用极大的缩短了侵染的时间。
[0023]3、本专利技术采用的诱导培养基和增殖培养基诱导率为100％，增殖率10天左右就可以翻倍，能够在短时间内提供充足的转化材料。
[0024]4、在构建重组载体时，选择在GUS基因上游插入35S强启动子，使其过表达，便于后期进行转基因效果的鉴定。
[0025]5、本专利技术方法，可以将任何基因瞬时转化至葡萄愈伤组织中，时间短，效率高，能在3
‑
4周时间内诱导出愈伤组织，并且在有足够愈伤组织的情况下，在2天的时间就能获得瞬时转化的愈伤组织。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0027]图1为本专利技术在诱导培养基诱导生成的愈伤组织，其中A为诱导3
‑
4周状态良好的愈伤组织，B为诱导3
‑
4周生成的愈伤组织；
[0028]图2为本专利技术在增殖培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用葡萄愈伤组织瞬时转化外源基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)葡萄愈伤组织的制备：取无菌葡萄叶片，诱导培养3
‑
4周，获得愈伤组织，再经过增殖培养，获得侵染材料；(2)侵染菌液的制备：取过表达GUS基因的农杆菌菌株接种于含抗生素的LB液体培养基中恢复培养，然后转移至含抗生素的LB液体培养基中扩大培养，扩大培养的菌液离心后，取沉淀，悬浮再离心，去除上清液，重复2
‑
3次，取最终沉淀后悬浮，获得侵染菌液；(3)农杆菌对葡萄愈伤组织的侵染：将步骤(1)获得的侵染材料加入到步骤(2)获得的侵染菌液中，超声后真空处理，获得侵染后的愈伤组织；(4)农杆菌侵染后的培养：取侵染后的愈伤组织，吸干菌液后共培养，共培养后的愈伤组织进行脱菌处理，获得脱菌后的愈伤组织。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述诱导培养的培养基为3.21g/L B5培养基，0.5mg/LNAA，2.0mg/L 6
‑
BA，60g/L蔗糖，0.5g/L活性炭，3.0g/L植物凝胶，pH 5.8
‑
5.9；所述诱导培养的培养条件为25
±
1℃，黑暗培养。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述增殖培养的培养基为3.21g/L B5培养基，0.05mg/LNAA，0.5mg/L 2,4
‑
D，2...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐伟荣，吴洁萍，张宁波，郝新意，
申请(专利权)人：宁夏大学，
类型：发明
国别省市：