一种高效甘蔗转基因方法技术

本发明专利技术提供一种高效甘蔗转基因方法，属于植物生物技术领域，所述转基因方法是以脱毒甘蔗种苗诱导的甘蔗胚性愈伤组织作为受体材料，利用抗除草剂基因bar或除草剂基因CP4

【技术实现步骤摘要】
一种高效甘蔗转基因方法


[0001]本专利技术涉及作物转基因方法，尤其涉及一种高效甘蔗转基因方法。

技术介绍

[0002]甘蔗是温带和热带农作物，是制造蔗糖的原料，且可提炼乙醇作为能源替代品。全世界有一百多个国家出产甘蔗，最大的甘蔗生产国是巴西、印度和中国。甘蔗中含有丰富的糖分、水分，还含有对人体新陈代谢非常有益的各种维生素、脂肪、蛋白质、有机酸、钙、铁等物质，主要用于制糖。
[0003]甘蔗在我国台湾、福建、广东、海南、广西、四川、云南等南方热带地区广泛种植，是我国和世界最主要的糖料作物和重要的生物乙醇来源。甘蔗品种的持续遗传改良，关乎甘蔗产业健康发展。
[0004]然而在甘蔗种植过程中，杂草会与甘蔗竞争性争夺水分、养分、阳光及空间等，阻碍甘蔗的生长，因此杂草危害也是众多影响甘蔗产量的一个主要因素。传统人工除草成本昂贵、耗费时间长，效果也不显著。草铵膦和草甘膦均是高效低毒的化学除草剂，可以有效降低除草劳动强度、提高除草效率。但现有的甘蔗种苗抗草铵膦或草甘膦的效果较差，种植过程中喷施草铵膦或草甘膦可能会影响甘蔗生长。
[0005]为提高甘蔗种苗的抗草铵膦或抗草甘膦效果，本领域技术人员开始尝试通过转基因的方式来对种苗进行遗传转化，但现有的转基因方法转化率较低、阳性率也有待提高，整体育种成本较高，具体如下：专利号为 202210545664.0的专利技术专利公开了一种农杆菌介导甘蔗愈伤组织高效遗传转化方法，但其利用根瘤农杆菌介导甘蔗愈伤遗传转化效率仅为8.06～14.89％，转化率较低，育种成本较高。
[0006]专利号为202010867548.1的专利技术专利公开了一种农杆菌介导甘蔗生长点遗传转化的方法，其阳性率虽然可达到94.33％，但仍会导致转化过程中原料的浪费，增加转化成本，因此该方法的阳性率仍有待提高。
[0007]而针对抗草甘膦的抗性甘蔗，目前并没有相对成熟的转基因技术。

技术实现思路

[0008]针对上述问题，本专利技术提供一种高效甘蔗转基因方法。
[0009]为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：
[0010]一种高效甘蔗转基因方法，所述转基因方法包括以下步骤：
[0011]1)胚性愈伤组织和工程菌液的制备：
[0012]取甘蔗制备胚性愈伤组织；
[0013]取含Bar基因筛选标记质粒植物表达载体的EHA105农杆菌菌株或含 CP4
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EPSPS基因筛选标记质粒植物表达载体的EHA105农杆菌菌株制备相应的农杆菌工程菌液(即含Bar基因筛选标记质粒植物表达载体的农杆菌工程菌液和含CP4
‑
EPSPS基因筛选标记质粒植物表达载体的农杆菌工程菌液)；
[0014]2)共培养胚性愈伤组织的制备：
[0015]将胚性愈伤组织风干后，加入相应的农杆菌工程菌液进行第一次暗培养，然后经超声波处理，更换相应的农杆菌工程菌液进行真空处理，然后再经第二次暗培养，取出相应的培养后的胚性愈伤组织并吸干农杆菌工程菌液后，置于共培养培养基中进行第三次暗培养，得相应的共培养后的胚性愈伤组织(即转bar筛选标记基因的胚性愈伤组织和转CP4
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EPSPS筛选标记基因的胚性愈伤组织)；
[0016]3)抗性植株的制备：
[0017]共培养后的胚性愈伤组织移至恢复培养基中，经恒温暗恢复培养后，再转移至胚性愈伤组织筛选培养基中进行胚性愈伤组织筛选培养，所得相应的抗性愈伤组织转移至分化筛选培养基中进行分化筛选培养，并在分化筛选培养结束后挑取长势较好的幼芽转移至生根筛选培养基中进行生根筛选培养，在生根筛选培养过程中间更换生根筛选培养基，并在更换生根筛选培养基时挑取较健壮的植株进行生根培养，生根培养完成后，去除侧生芽，即得相应的抗性植株(即带Bar筛选标记的抗性植株和带CP4
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EPSPS筛选标记的抗性植株)。
[0018]进一步的，所述抗性植株经相应的抗性鉴定，得相应的抗性结果为阳性的转基因植株(即带Bar筛选标记的转基因植株和带CP4
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EPSPS筛选标记的转基因植株)；
[0019]所述转基因植株的苗期分子检测方法包括以下步骤：
[0020]将转基因植株进行开放式练苗，待转基因植株叶片直立后，相应的喷洒田间使用浓度的草铵膦除草剂或草甘膦除草剂进行抗除草剂测试；
[0021]结果显示：
[0022]利用含Bar基因筛选标记质粒植物表达载体的EHA105农杆菌菌株制备的转基因植株(带Bar筛选标记的转基因植株)均具备抗草铵膦除草剂特性；
[0023]利用含CP4
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EPSPS基因筛选标记质粒植物表达载体的EHA105农杆菌菌株制备的转基因植株(带CP4
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EPSPS筛选标记的转基因植株)均具备抗草甘膦除草剂特性。
[0024]进一步的，所述抗性鉴定是取抗性植株编号后，剪取18～22mg叶片组织研磨后，利用Bar基因试剂盒或EPSPS基因试剂盒进行检测。
[0025]进一步的，所述农杆菌工程菌液的制备过程包括以下步骤：
[0026]取携带含Bar基因筛选标记质粒植物表达载体的EHA105农杆菌菌株或 CP4
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EPSPS基因筛选标记质粒植物表达载体的EHA105农杆菌菌株相应的置于含卡那霉素的固体YEP平板培养基或含壮观霉素的固体YEP平板培养基中划线培养至长出相应的单菌落，挑取相应的单菌落置于含相应抗生素的液体YEP培养基中震荡培养，离心收集相应的农杆菌菌体，再通过启动培养基进行悬浮培养，并稀释后，即得相应的所述农杆菌工程菌液。
[0027]进一步的，含卡那霉素的固体YEP平板培养基是在每升YEP培养基中添加50mg的卡那霉素、200～300μmol乙酰丁香酮和14～16g琼脂，并调节 pH值至6.8～7.2；
[0028]含壮观霉素的固体YEP平板培养基是在每升YEP培养基中添加100mg 的壮观霉素、200～300μmol乙酰丁香酮和14～16g琼脂，并调节pH值至 6.8～7.2；
[0029]含卡那霉素的液体YEP培养基是在每升YEP培养基中添加50mg的卡那霉素和200～300μmol乙酰丁香酮，并调节pH值至6.8～7.2；
[0030]含壮观霉素的液体YEP培养基是在每升YEP培养基中添加100mg的壮观霉素和200～300μmol乙酰丁香酮，并调节pH值至6.8～7.2；
[0031]启动培养基是在每升B5培养基中添加28～32g蔗糖、28～32g葡萄糖和 200～300μmol乙酰丁香酮，并调节pH值至5.1～5.3；
[0032]悬浮培养的时间为1～2h；
[0033]震荡培养过程中还需对震荡培养的相应的农杆菌菌液进行分子鉴定，确定菌株的准确性；
[0034]所述农杆菌工程菌液的OD600为0.3～0.6。
[0035]进一步的，步骤2)中，共培养培养基是在每升本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效甘蔗转基因方法，其特征在于，所述转基因方法包括以下步骤：1)胚性愈伤组织和工程菌液的制备：取甘蔗制备胚性愈伤组织；取含Bar基因筛选标记质粒植物表达载体的EHA105农杆菌菌株或含CP4
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EPSPS基因筛选标记质粒植物表达载体的EHA105农杆菌菌株制备相应的农杆菌工程菌液；2)共培养胚性愈伤组织的制备：将胚性愈伤组织风干后，加入相应的农杆菌工程菌液进行第一次暗培养，然后经超声波处理，更换相应的农杆菌工程菌液进行真空处理，然后再经第二次暗培养，取出相应的培养后的胚性愈伤组织并吸干农杆菌工程菌液后，置于共培养培养基中进行第三次暗培养，得相应的共培养后的胚性愈伤组织；3)抗性植株的制备：共培养后的胚性愈伤组织移至恢复培养基中，经恒温暗恢复培养后，再转移至胚性愈伤组织筛选培养基中进行胚性愈伤组织筛选培养，所得相应的抗性愈伤组织转移至分化筛选培养基中进行分化筛选培养，并在分化筛选培养结束后挑取长势较好的幼芽转移至生根筛选培养基中进行生根筛选培养，在生根筛选培养过程中间更换生根筛选培养基，并在更换生根筛选培养基时挑取较健壮的植株进行生根培养，生根培养完成后，去除侧生芽，即得相应的抗性植株。2.根据权利要求1所述的一种高效甘蔗转基因方法，其特征在于，所述抗性植株经相应的抗性鉴定，得相应的抗性结果为阳性的转基因植株；所述转基因植株的苗期分子检测方法包括以下步骤：将转基因植株进行开放式练苗，待转基因植株叶片直立后，相应的喷洒田间使用浓度的草铵膦除草剂或草甘膦除草剂进行抗除草剂测试。3.根据权利要求2所述的一种高效甘蔗转基因方法，其特征在于，所述抗性鉴定是取抗性植株，剪取叶片组织研磨后，利用Bar基因试剂盒或EPSPS基因试剂盒进行检测。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的一种高效甘蔗转基因方法，其特征在于，所述农杆菌工程菌液的制备过程包括以下步骤：取携带含Bar基因筛选标记质粒植物表达载体的EHA105农杆菌菌株或CP4
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EPSPS基因筛选标记质粒植物表达载体的EHA105农杆菌菌株相应的置于含卡那霉素的固体YEP平板培养基或含壮观霉素的固体YEP平板培养基中划线培养至长出相应的单菌落，挑取相应的单菌落置于含相应抗生素的液体YEP培养基中震荡培养，离心收集相应的农杆菌菌体，再通过启动培养基进行悬浮培养，并稀释后，即得相应的所述农杆菌工程菌液。5.根据权利要求4所述的一种高效甘蔗转基因方法，其特征在于，含卡那霉素的固体YEP平板培养基是在每升YEP培养基中添加50mg的卡那霉素、200～300μmol乙酰丁香酮和14～16g琼脂，并调节pH值至6.8～7.2；含壮观霉素的固体YEP平板培养基是在每升YEP培养基中添加100mg的壮观霉素、200～300μmol乙酰丁香酮和14～16g琼脂，并调节pH值至6.8～7.2；含卡那霉素的液体YEP培养基是在每升YEP培养基中添加50mg的卡那霉素和200～300μmol乙酰丁香酮，并调节pH值至6.8～7.2；含壮观霉素的液体YEP培养基是在每升YEP培养基中添加100mg的壮观霉素和200～300μmol乙酰丁香酮，并调节pH值至6.8～7.2；
启动培养基是在每升B5培养基中添加28～32g蔗糖、28～32g葡萄糖和200～300μmol乙酰丁香酮，并调节pH值至5.1～...

【专利技术属性】
技术研发人员：王文治，张树珍，杨本鹏，谭贤教，冯翠莲，王俊刚，赵婷婷，沈林波，冯小艳，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院三亚研究院，
类型：发明
国别省市：