System.ArgumentOutOfRangeException: 索引和长度必须引用该字符串内的位置。 参数名: length 在 System.String.Substring(Int32 startIndex, Int32 length) 在 zhuanliShow.Bind() 甘蔗条点病毒荧光定量PCR检测引物、试剂盒及方法技术_技高网

甘蔗条点病毒荧光定量PCR检测引物、试剂盒及方法技术

技术编号:40826376 阅读:16 留言:0更新日期:2024-04-01 14:47
本发明专利技术涉及甘蔗条点病毒荧光定量PCR检测引物、试剂盒及方法,引物对包括上游引物SStrV‑F1和下游引物SStrV‑R1,该引物对的序列如序列表中SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2所示,并依据该对引物建立了甘蔗条点病毒荧光定量PCR检测的方法,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,能对SStrV病毒进行精准检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒核酸检测,具体涉及甘蔗条点病毒荧光定量pcr检测引物、试剂盒及方法。


技术介绍

1、甘蔗(saccharum officinarum l.)是禾本科多年生的产糖作物,世界主要的糖料作物、经济作物及重要的能源作物,亦是我国重要的糖料作物和经济作物。2022年,我国甘蔗的种植面积为1686.80万亩,甘蔗糖产量为897万吨,占我国食糖总产量的87.96%。甘蔗是无性繁殖作物,在生长过程中受到各种病毒的感染。随着甘蔗产业的发展,病毒病害对甘蔗产量的影响日益严重。目前,危害甘蔗的病毒按照遗传物质可以分为dna病毒和rna病毒。rna病毒主要有甘蔗花叶病毒(sugarcane mosaic virus,scmv)、高粱花叶病毒(sorghummosaic virus,srmv)、甘蔗线条花叶病毒(sugarcane streak mosaic disease virus,scsmv)和甘蔗黄叶病毒(sugarcane yellow leaf virus,scylv),dna病毒主要有甘蔗杆状病毒(sugarcane bacilliform virus,scbv)和甘蔗条点病毒(sugarcane striate virus,sstrv)。甘蔗条点病毒是2015年发现的一种新病毒,该病毒首次发现于美国佛罗里达州、法国瓜德罗普省和留尼汪岛的甘蔗种质资源中;其属于双生病毒科(geminiviridae)玉米线条病毒属(mastrevirus),具有约2.7 kb的环状单链dna单体基因组。sstrv侵染甘蔗后,甘蔗表现为白色斑点、褪绿条纹或短节间状等症状。

2、yinfu lin等对我国甘蔗条点病毒的发生、地理分布及遗传多样性进行了研究,发现sstrv在我国蔗区平均发病率为25.1%,广西、云南、广东、海南和福建等地均有sstrv发生,广东蔗区sstrv检出病率甚至高达90.3%。可见sstrv已经在我国蔗区普遍发生。目前,sstrv的寄主范围包括有在糖料蔗、果蔗和甘蔗相关种质资源(大茎野生种、割手密、竹蔗、斑茅和蔗茅)。由sstrv分离株的全长基因组构建的系统进化树显示,sstrv分离株被分为四个不同的组:a,b,c和d。中国分离株a和b组组成,但不包括c和d组。sstrv a组是我国最突出、分布最广的毒株(占98.7%),分为8个亚组,在8个亚种组中,i亚组最具优势,分布最广。

3、目前对sstrv的研究报道较少,仅对sstrv发生、地理分布及遗传多样性有少量报道,对该病毒种群的起源及其流行发生的机制、分子进化机制、传播介体等尚不清楚。同时sstrv的检测方法较为单一,只有聚合酶链式反应(pcr)一种,常规pcr虽然操作简单,但是只能定性不能定量,灵敏度也不高,对于病毒含量较少的样品,检测效果不佳。因此需要研发更多检测方法来鉴定sstrv。


技术实现思路

1、本研究对已报道sstrv分离物的全基因组序列进行分析,根据保守序列设计特异性引物,建立sstrv的荧光定量pcr(qpcr)检测法,该方法具有灵敏度高、特异性好等优点,且能对样品中的sstrv病毒进行定量检测。本研究应用该方法对甘蔗不同部位组织中的sstrv载量进行了鉴定。

2、具体地:

3、甘蔗条点病毒荧光定量pcr检测引物,包括:

4、上游引物sstrv-f1:5’-cttaggggaactcgttcggg-3’;

5、下游引物sstrv-r1:5’-cgattccacccttcctcacc-3’。

6、上述pcr检测引物在甘蔗条点病毒检测中的应用。

7、其中,扩增的反应条件为:95ºc预变性3min,再以40个循环进行扩增,每个循环95ºc变性10s,60ºc退火延伸30s。

8、其中,扩增模板取自甘蔗的+4叶。

9、甘蔗条点病毒荧光定量pcr检测试剂盒,包括:

10、上游引物sstrv-f1:5’-cttaggggaactcgttcggg-3’;

11、下游引物sstrv-r1:5’-cgattccacccttcctcacc-3’。

12、该试剂盒包括以下试剂:阳性对照标准品、pcr反应液和阴性对照;

13、所述阳性对照标准品为含有甘蔗条点病毒基因序列的重组质粒,pcr反应液包括上游引物sstrv-f1、下游引物sstrv-r1、2 × taq plus master mix,阴性对照为双蒸水。

14、其中,重组质粒以pmd19-t为载体。

15、本专利技术的有益效果为:

16、本研究对已报道sstrv分离物的全基因组序列进行分析,根据保守序列设计特异性引物,建立了sstrv的荧光定量pcr(qpcr)检测法,经过对反应条件的优化,绘制的标准曲线中cq值与标准品浓度拷贝数的对数呈良好的线性关系,熔解曲线峰值单一,该qpcr检测法特异性好,能特异性的检测出sstrv,不能检测出scbv、scmv、scsmv、srmv、scylv等甘蔗病毒。敏感性试验显示建立的sstrv荧光定量pcr方法的敏感性是常规pcr方法的100倍。组内重复和组间重复试验结果为组内和组间重复变异系数均小于1%,表明建立的sstrv荧光定量pcr方法具有良好的重复性。综上所述,本研究建立sstrv荧光定量pcr方法具有特异性高、灵敏度高、重复性好等优点,能对sstrv病毒进行精准检测。

17、本研究利用建立sstrv的荧光定量pcr检测法对8个甘蔗品种不同组织部位sstrv的载量进行了鉴定,结果发现在8个甘蔗品种中,sstrv的载量差异较大,这可能与甘蔗品种本身的特性有关。在8个甘蔗品种的7个组织部位(-1叶、+1叶、+2叶、+4叶、根、茎和芽)中,+4叶的sstrv的载量均为最高,与其他组织部位达到显著差异。其次,+2叶中sstrv的载量也较高。

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【技术保护点】

1.甘蔗条点病毒荧光定量PCR检测引物,其特征在于,包括:

2.根据权利要求1所述的PCR检测引物在甘蔗条点病毒检测中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,扩增的反应条件为:95ºC预变性3min,再以40个循环进行扩增,每个循环95ºC变性10s,60ºC退火延伸30s。

4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,扩增模板取自甘蔗的+4叶。

5.甘蔗条点病毒荧光定量PCR检测试剂盒,其特征在于,包括:

6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,包括以下试剂:阳性对照标准品、PCR反应液和阴性对照;

7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述重组质粒以pMD19-T为载体。

8.根据权利要求5至7任一所述的试剂盒于甘蔗条点病毒荧光定量PCR检测中的应用。

【技术特征摘要】

1.甘蔗条点病毒荧光定量pcr检测引物,其特征在于,包括:

2.根据权利要求1所述的pcr检测引物在甘蔗条点病毒检测中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,扩增的反应条件为:95ºc预变性3min,再以40个循环进行扩增,每个循环95ºc变性10s,60ºc退火延伸30s。

4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,扩增模板取自甘蔗...

【专利技术属性】
技术研发人员:沈林波张树珍王文治孙婷婷王超敏
申请(专利权)人:中国热带农业科学院三亚研究院
类型:发明
国别省市:

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