一种基于基因编辑技术创制水稻新型两系不育系的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于基因编辑技术创制水稻新型两系不育系的方法，属于基因工程领域和作物遗传育种领域。本发明专利技术方法为利用CRISPR/Cas9技术定点编辑两系不育系水稻中控制籼粳杂种胚囊败育基因S5，通过造成S5的移码突变，敲除水稻S5基因。本发明专利技术克服了水稻籼粳亚种间杂种的不育性，使得籼粳稻亚种杂交的杂种优势在杂交水稻中的应用成为可能，具有良好的开发和运用前景。的开发和运用前景。的开发和运用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于基因编辑技术创制水稻新型两系不育系的方法


[0001]本专利技术属于基因工程领域和作物遗传育种领域，涉及一种基于基因编辑技术创制水稻新型两系不育系的方法。

技术介绍

[0002]水稻是世界上最主要的粮食作物之一，也是我国最重要的粮食作物。随着人口的不断增加，耕地面积不断减少，如何提高水稻产量已成为学者们亟待解决的问题。1987年，袁隆平提出了杂交水稻的战略规划，以光温敏核不育水稻(以下简称“两系不育系”)为基础的两系法杂交水稻研究迅速展开，在两系杂交稻的选育、推广及应用上取得了重大突破。但杂交水稻的配制主要以亚种内杂交——籼籼杂交为主，而亚种间杂交一直未突破。籼稻和粳稻杂交产生的F1后代具有较强的杂种优势，主要表现在植株高大、根系发达、分蘖旺盛等方面；但是由于籼稻和粳稻之间存在生殖隔离，导致杂种F1的小穗育性很低，进而阻碍了亚种间杂种优势的利用，这也是两系法无法突破亚种杂交的原因之所在。
[0003]在“两系法”中，培育具有优良性状的不育系为杂交水稻的核心及重难点，其中分子标记辅助选择发挥着重要作用。分子标记辅助选择是利用与目的基因紧密连锁或者共分离的分子标记来选择个体。通过系统自交和回交，利用分子标记在分子水平确定材料中是否含有所需的目的基因，从而使供体染色体片段渗入到受体亲本，是将分子标记应用于作物品种改良过程中进行选择的一种有效手段。传统的水稻育种通过观察表型间接选择基因型，育种时间长且还受诸多因素的影响，具有盲目性和不可预测性；而分子标记辅助选择不受其他基因效应和环境因素的影响，是对目标性状在分子水平上的一种选择，选择结果可靠，但这些材料常常会含有较多的不利基因，有些甚至与目标基因连锁，通过常规的方法很难打破连锁。但这些材料常常会含有较多的不利基因，有些甚至与目标基因连锁，通过常规的方法很难打破连锁。
[0004]CRISPR
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Cas9基因编辑技术能直接对目标性状的基因进行修饰，操作简单、敲除效率高、育种周期短，能大幅度提高目标性状聚合的精准度，从而加快育种进程。目前，利用CRISPR/Cas9技术在改良水稻产量、品质、抗性、育性、株型等重要性状方面已取得重要进展。基因编辑技术应用于作物遗传改良，主要是通过靶基因的定点突变造成基因功能缺失以实现性状改良，故敲除的基因必须都是目标性状负调控基因。S5是控制籼粳杂种F1雌配子败育的代表性位点，其编码一种天冬氨酸蛋白酶，而广亲和品种S5
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n在编码区5
’
端缺失了136bp导致信号肽缺失，从而引起蛋白定位发生改变以及功能的丧失。通过对两系不育系S5位点的基因编辑，使其与籼稻、粳稻杂交的F1都正常可育，从而在两系不育系配组中能够利用亚种间的杂种优势。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种基于基因编辑技术创制水稻新型两系不育系的方法，以克服水稻籼粳亚种间杂种的不育性，从而利用籼粳亚种间强
大的杂种优势提高水稻产量。
[0006]为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0007]一种基于基因编辑创制水稻新型两系不育系的方法，为利用CRISPR/Cas9技术定点编辑两系不育系水稻中控制籼粳杂种胚囊败育基因S5，通过造成S5的移码突变，敲除水稻S5基因，获得具有广亲和特性的两系不育系水稻。
[0008]进一步地，所述的基于基因编辑创制水稻新型两系不育系的方法，包括如下步骤：针对两系不育系S5基因的信号肽编码区域设计两对靶点，构建含有靶点序列的pCRISPR/Cas9
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S5
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gRNA重组表达载体，将重组表达载体利用农杆菌介导的方法转化水稻两系不育系，使两系不育系中的S5基因的信号肽缺失或使该基因的功能丧失，从而获得具有广亲和特性的两系不育系水稻。
[0009]进一步地，所述的两系不育系为Bph68S。
[0010]进一步地，所述的两对靶点分别为靶点1和2、靶点3和4，其序列分别为：
[0011]1)靶点1：TACTCAGGGGCAGGATTCGT，
[0012]2)靶点2：GTAGCAGCTGCAGCTGCAAC；
[0013]3)靶点3：AGTCATTGTTACTCAGGGGC，
[0014]4)靶点4：GGGACACTCCAACTCGTCGT。
[0015]通过上述方法得到具有广亲和特性的两系不育系水稻可作为母本与具有优良性状的两系恢复系父本配成两系杂交水稻组合，进行杂交制种。所述的两系恢复系父本包括9391、7375武科粳、南粳83111、南粳83043、金香玉1号、宁香粳11。
[0016]一种使水稻S5基因信号肽缺失或使水稻S5基因功能丧失的基因编辑位点，为靶点1和2、靶点3和4，其序列分别为：
[0017]1)靶点1：TACTCAGGGGCAGGATTCGT，
[0018]2)靶点2：GTAGCAGCTGCAGCTGCAAC；
[0019]3)靶点3：AGTCATTGTTACTCAGGGGC，
[0020]4)靶点4：GGGACACTCCAACTCGTCGT。
[0021]上述因编辑位点可用于制备杂交水稻两系不育系材料。
[0022]传统的水稻育种往往以依赖于表型选择和育种家经验，育种周期长、选择效率低下。本专利技术利用基因编辑技术定向改良水稻育性，大大地缩短了育种周期，提高了育种效率，同时为选育水稻新种质提供了强有力的技术支撑。
[0023]通过本专利技术克服了水稻籼粳亚种间杂种的不育性，所得籼粳交F1代植株的结实率超过了80％。本专利技术使得籼粳稻亚种杂交的杂种优势在杂交水稻中的应用成为可能，具有良好的开发和运用前景。
附图说明
[0024]图1是Bph68S的S5位点基因型鉴定。
[0025]图2是pYLCRISPR/Cas9
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S5
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gRNA载体构建。A，pYLCRISPR/Cas9
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S5
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gRNA载体构建示意图；B，S5基因结构和靶点序列；C，sgRNA表达盒的扩增；D，PCR扩增鉴定阳性S5敲除载体。
[0026]图3是CRISPR/Cas9系统诱导的S5突变体。其中，#B
‑
1～B
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13为T0代单株；PAM结构
以绿色字体表示，红色字体显示的插入突变或缺失突变，蓝色表示信号肽编码序列，黄色表示起始密码子。WT，野生型；Bi.M，双等位突变；Ho.M，纯合突变；Het，杂合突变。
[0027]图4是Bph68S与Balilla杂交F1代的育性。
[0028]图5是亲本及F1的植株形态比较。从左到右、从上到下依次为Bc
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1与9391、7375武科粳、南粳83111、南粳83043、金香玉1号、宁香粳11的组合。
具体实施方式
[0029]以下实施例用于进一步说明本专利技术，但本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于基因编辑创制水稻新型两系不育系的方法，其特征在于，所述的方法为利用CRISPR/Cas9技术定点编辑两系不育系水稻中控制籼粳杂种胚囊败育基因S5，通过造成S5的移码突变，敲除水稻S5基因，获得具有广亲和特性的两系不育系水稻。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：针对两系不育系S5基因的信号肽编码区域设计两对靶点，构建含有靶点序列的pCRISPR/Cas9
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S5
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gRNA重组表达载体，将重组表达载体利用农杆菌介导的方法转化水稻两系不育系，使两系不育系中的S5基因的信号肽缺失或使该基因的功能丧失，从而获得具有广亲和特性的两系不育系水稻。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的两系不育系为Bph68s。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的两对靶点分别为靶点1和2、靶点3和4，其序列分别为：1)靶点1：TACTCAGGGGCAGGATTCGT，2)靶点2：GTAGCAGCTGCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：窦杨凡，耿涵，但志武，黄文超，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：