一种田菁的遗传转化方法技术

本发明专利技术涉及植物遗传转化技术领域，尤其是涉及一种田菁的遗传转化方法。本发明专利技术提供的转化方法包括以下步骤：(1)田菁无菌苗的制备、(2)外植体预培养、(3)侵染与共培养、(4)恢复培养、(5)筛选培养、(6)分化培养、(7)生根培养。该方法以田菁的子叶或下胚轴为起始外植体，建立起一种快速有效的再生体系。该方法首次建立了农杆菌介导的田菁的草甘膦筛选转化体系，填补了田菁遗传转化体系的空白。了田菁遗传转化体系的空白。了田菁遗传转化体系的空白。

【技术实现步骤摘要】
一种田菁的遗传转化方法


[0001]本专利技术属于植物遗传转化领域，具体涉及一种田菁的遗传转化方法。

技术介绍

[0002]田菁，为一年生草本豆科植物，喜温暖气候，具有很强的耐盐、耐涝、耐瘠能力，是改良盐碱地的先锋绿肥作物，在盐碱地区具有较大的推广价值。此外，在工业和医学领域也发现了田菁的利用价值：田菁茎皮的耐腐蚀程度和纤维拉力均优于黄麻，是黄麻的理想代用品；从田菁种子胚乳中提取的田菁胶是一种天然多糖类高分子物质，其主要成分为D
‑
半乳糖和D
‑
甘露糖，可用做食品的乳化剂、增稠剂和稳定剂，以改善食品的质量。
[0003]田菁在生态学、生理生化特性、栽培种植技术等方面有一定的研究，而在转基因和遗传转化方面的研究极少。由于可利用资源少和遗传能力弱等限制因素，严重制约了田菁深入研究的开展。为解决上述问题，最有效的手段就是通过生物技术方法对田菁进行遗传改良。
[0004]田菁的遗传转化体系尚为空白，田菁的转化体系建立及转基因材料的获得对于田菁性状改良和应用具有重大意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种田菁的遗传转化方法，填补田菁遗传转化体系的空白。
[0006]本专利技术提供的技术方案如下：
[0007]一种田菁的遗传转化方法，包括以下步骤：
[0008](1)田菁无菌苗的制备：将灭菌的田菁种子接种至1/2MS固体培养基中培养，得到无菌苗；
[0009](2)外植体预培养：从所述无菌苗上切取外植体部位，将外植体接种至预培养基上进行预培养；
[0010](3)侵染与共培养：将所述外植体与农杆菌侵染液浸染5
‑
10min，所述农杆菌侵染液含有乙酰丁香酮，侵染结束后吸干外植体水分，放入共培养培养基中暗培养2
‑
4d，得到共培养外植体；
[0011](4)恢复培养：将所述共培养外植体于25℃光照下进行恢复培养；
[0012](5)筛选培养：将恢复后的组织转移到筛选培养基，于25℃下光培养，筛选得到抗性愈伤组织；
[0013](6)将所述抗性愈伤组织转移到分化培养基上，于25℃下培养分化，得到田菁幼苗；
[0014](7)生根培养：将所述田菁幼苗转移到生根培养基，25℃下培养至株高约10cm，得到田菁转基因植株。
[0015]进一步的，步骤(1)中，所述1/2MS固体培养基的成分为：MS盐2g/L、B5维他命3g/L、
蔗糖15g/L、琼脂10g/L，培养时间为7
‑
10天。
[0016]进一步的，步骤(1)中，所述灭菌的具体方法为将田菁种子依次用纱布包裹、80℃水浴锅中煮15min、75％酒精消毒2次、40％ NaCl消毒2次、无菌水冲洗4～5次每次15min，然后去除表面水分。
[0017]进一步的，步骤(2)中，所述预培养培养基的成分为：MS盐4.3g/L、B5维他命3g/L、蔗糖20g/L、琼脂10g/L、MES 4g/L、生长素(IAA)0.5mg/L、6
‑
苄基腺嘌呤(6
‑
BAP)1mg/L，pH5.6，培养时间为2
‑
4天，优选为3天。
[0018]进一步的，步骤(3)中，所述农杆菌侵染液的OD660为0.4
‑
0.6；所述共培养培养基的组成为：MS盐3g/L、B5维他命2g/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、MES 2g/L、萘乙酸(NAA)2mg/L、AS 20mg/L、半胱氨酸50mg/L、琼脂8g/L，pH5.6，共培养时间为2
‑
4天，共培养温度为22℃。
[0019]在一个具体的实施方式中，所述外植体为田菁的下胚轴；此时步骤(3)中所述外植体与农杆菌侵染液共培养时用超声波处理，侵染时间为5min，所述农杆菌侵染液含有40mg/L浓度的乙酰丁香酮。
[0020]在一个具体的实施方式中，所述外植体为田菁的子叶；此时步骤(3)中所述外植体与农杆菌侵染液共培养进行侵染的时间为2
‑
4min，所述农杆菌侵染液含有20mg/L浓度的乙酰丁香酮。
[0021]进一步的，步骤(4)中，所述恢复培养基的组成为：MS盐3g/L、B5维他命4g/L、MES 1g/L、蔗糖30g/L、激动素(KT)0.5mg/L、6
‑
苄基腺嘌呤(6
‑
BAP)1mg/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、谷氨酸100mg/L、天冬氨酸100mg/L，pH5.6，培养时间为7
‑
10天。
[0022]进一步的，步骤(5)中，所述筛选培养基的组成为：MS盐2g/L、B5维他命4g/L、B5维他命4g/L、MES 1g/L、蔗糖30g/L、头孢霉素0.2g/L、草甘膦30
‑
50mg/L、萘乙酸(NAA)0.5mg/L、6
‑
苄基腺嘌呤(6
‑
BAP)1mg/L、琼脂8g/L，pH5.6，培养时间为4周。
[0023]进一步的，步骤(6)中，所述分化培养基的组成为：MS盐2g/L、B5维他命4g/L、B5维他命4g/L、MES 1g/L、蔗糖30g/L、头孢霉素0.2g/L、草甘膦10
‑
30mg/L、玉米素(ZT)0.5
‑
3mg/L、琼脂8g/L，PH5.6。
[0024]进一步的，所述生根培养基的组成为：B5盐3g/L、B5维他命4g/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、萘乙酸(NAA)0.2
‑
1.0mg/L。
[0025]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0026](1)本专利技术建立的田菁遗传转化方法填补了田菁遗传转化体的空白。
[0027](2)本专利技术通过实验探究优化转化过程中的处理方式和培养条件，使用除草剂草甘膦作为筛选剂，得到转基因阳性株系，顺利建立稳定的农杆菌介导的田菁遗传转化体系。
[0028](3)本专利技术的遗传转化方法转化效率高，转化周期短，全部过程只需3
‑
4个月。
附图说明
[0029]图1A为本专利技术实施例1中得到的愈伤组织；图1B为实施例1中经筛选培养基筛选后得到的抗性愈伤组织；图1C为实施例1中经生根培养基培养后得到的植株。
具体实施方式
[0030]下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明，以下所述，仅是对本专利技术的较佳实施
例而已，并非对本专利技术做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的
技术实现思路
加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本专利技术方案内容，依据本专利技术的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本专利技术的保护范围内。
[0031]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种田菁的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)田菁无菌苗的制备：将灭菌的田菁种子接种至1/2MS固体培养基中培养，得到无菌苗；(2)外植体预培养：从所述无菌苗上切取外植体部位，将外植体接种至预培养基上进行预培养；(3)侵染与共培养：将所述外植体与农杆菌侵染液浸染5
‑
10min，所述农杆菌侵染液含有乙酰丁香酮，侵染结束后吸干外植体水分，放入共培养培养基中暗培养2
‑
4d，得到共培养外植体；(4)恢复培养：将所述共培养外植体于25℃光照下进行恢复培养；(5)筛选培养：将恢复后的组织转移到筛选培养基，于25℃下光培养，筛选培养后得到抗性愈伤组织；(6)将所述抗性愈伤组织转移到分化培养基上，于25℃下培养分化，得到田菁幼苗；(7)生根培养：将所述田菁幼苗转移到生根培养基，25℃下培养至株高约10cm，得到田菁转基因植株。2.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述1/2MS固体培养基的成分为：MS盐2g/L、B5维他命3g/L、蔗糖15g/L、琼脂10g/L，培养时间为7
‑
10天。3.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述灭菌的具体方法为将田菁种子依次用纱布包裹、80℃水浴锅中煮15min、75％酒精消毒2次、40％NaCl消毒2次、无菌水冲洗4～5次每次15min，然后去除表面水分。4.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述预培养培养基的成分为：MS盐4.3g/L、B5维他命3g/L、蔗糖20g/L、琼脂10g/L、MES4g/L、生长素(IAA)0.5mg/L、6
‑
苄基腺嘌呤(6
‑
BAP)1mg/L，pH5.6，培养时间为2
‑
4天，优选为3天。5.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(3)中，所述农杆菌侵染液的OD660为0.4
‑
0.6；所述共培养培养基的组成为：MS盐3g/L、B5维他命2g/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、MES 2g/L、萘乙酸(NAA)2mg/L、AS 20mg/L、半胱氨酸50mg/L、琼脂8g/L，pH5.6，共培养时间为2
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李涛，刘钊君，曹晓风，赵丽媛，卢娟，贾志伟，
申请(专利权)人：海南省崖州湾种子实验室中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：