基于根癌农杆菌真空渗透介导的桑树离体瞬时转化方法技术

本发明专利技术公开了基于根癌农杆菌真空渗透介导的桑树离体瞬时转化方法，具体为：将含有目的基因的根癌农杆菌摇菌培养后收集菌体，再用渗透缓冲液重悬得到农杆菌侵染液；先将桑树离体组织浸入渗透缓冲液中超声处理产生为微孔创伤，再将桑树离体组织浸入农杆菌侵染液中真空渗透侵染；其中，渗透缓冲液为：无菌双蒸水中含有10mM MES，10mM MgCl2，50～200μmol/L乙酰丁香酮(AS)，pH 5.6。本发明专利技术基于农杆菌真空渗透侵染法，克服了叶脉组织导致注射侵染效率低的难题，结合超声波处理，建立了快速、高效的桑树组培苗瞬时转化体系，可实现桑树基因的快速、高效及批量化功能验证。高效及批量化功能验证。高效及批量化功能验证。

【技术实现步骤摘要】
基于根癌农杆菌真空渗透介导的桑树离体瞬时转化方法


[0001]本专利技术属于桑树遗传转化
，具体涉及一种基于根癌农杆菌真空渗透介导的桑树离体瞬时转化方法。

技术介绍

[0002]桑树属桑科(Moraceae)桑属(Morus)多年生木本乔木植物，是家蚕的天然优质饲料，也是我国的传统药用植物，其果实(桑葚)、根、茎、叶及其加工副产物都具有较高的药用价值和保健功效。因此，桑树是一种重要的生态经济型林木。然而，传统桑蚕种养模式下形成的“重蚕轻桑”产业科学研究发展格局，导致桑树的基础研究薄弱，基因功能研究滞后，严重制约着桑树多元化发展和多用途综合开发利用。随着川桑(Morus notabilis Schneid.)(He et al.,2013)和白桑(Morus alba L.)(Jiao et al.,2020)基因组解析相继完成，以及桑树转录组测序数据的批量化产生，标记着桑树进入后基因组时代，大量桑树基因及其功能亟需进行验证和鉴定。因此，建立快速、高效的遗传转化体系是实现基因批量化功能鉴定的重要技术手段。
[0003]最早，平野等(1985)证实桑树能被农杆菌感染，随后众多研究者相继开展大量的桑树转基因研究，然而时至今日仍然没有建立起成熟稳定的桑树转基因体系。目前，桑树遗传转化方法主要有以下4种：(1)叶盘转化法；Machii等(1990)首次基于农杆菌介导的叶盘转化法将GUS基因和NPTII基因转入到桑树中，成功获得具有GUS酶活性的植株。吴成仓等(1992)通过叶盘转化法将天蚕抗菌肽B基因(人工合成)和GUS基因转入桑树中，经过筛选获得抗性愈伤组织。谈建中等(1999，2001)通过叶盘转化法将大豆球蛋白基因A1aB1b分别转化桑树叶盘与茎尖，经卡那霉素抗性筛选培养，获得A1aB1b转基因阳性植株。Shalini等(2008)和Manaswini等(2011)通过农杆菌介导的叶盘转化法将外源基因导入印度桑
‘
K2
’
，均成功获得了转基因阳性植株。(2)基因枪轰击法；除了传统的农杆菌介导的植物组织培养转化法以外，基因枪技术在桑树转基因研究中也得到了应用。Machii等(1996)通过基因枪轰击法将GUS基因成功导入桑树悬浮愈伤组织中，但最终未能获得转基因植株。王洪利等(2003)采用基因枪法成功将水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因(OC)转入到桑树品种新一之濑中。(3)植株转化法，植株转化法是以植物茎尖或腋芽为受体材料，通过注射接种农杆菌进行转化的方法。陆小平等(2004)首次报道采用农杆菌侵染被针刺伤后的桑树腋芽，对感染部位长出的表型异常桑芽进行鉴定，证实目的基因成功导入。林天宝等(2018)将携带GUS和Kan基因的农杆菌菌液注射桑树冬芽，经GUS染色、PCR检测和卡那霉素抗性筛选，证实GUS基因成功已转入桑树。(4)花粉管通道法，花粉管通道法是在植物授粉后直接注射DNA溶液于子房，利用受精过程中花粉伸长的花粉管，将外源基因转入受精的卵细胞，并进一步整合到基因组中，最终获得转基因个体。李镇刚等(2014)利用花粉管通道法结合农杆菌介导法对桑树进行了转化，经PCR鉴定获得转phy C基因的桑树植株。此外，张大燕等(2015)基于农杆菌介导注射法，探索了缓冲液、农杆菌菌液浓度、转化时间、桑树品种等对桑树叶片瞬时转化效率的影响，并初步构建了农杆菌介导的桑树叶片瞬时转化体系。李瑞雪等(2018)报
道了农杆菌介导的病毒诱导基因沉默(VIGS)转化体系，并成功将桑树PDS基因沉默导致叶片出现白化现象。
[0004]目前，桑树遗传转化研究仍存在以下一些问题：(1)稳定遗传转化效率和再生率低。桑树为多年生木本植物，难以建立成熟的再生体系，基因型依赖性强；(2)瞬时转化效率低。现有农杆菌介导的桑树活体叶片瞬时转化均采用注射侵染法，由于桑树叶片薄，叶脉多，导致注射侵染和农杆菌转化效率低，无法实现快速、高效及批量化基因功能验证。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的问题，本专利技术旨在建立快速、高效的桑树组培苗瞬时转化体系，以实现桑树基因的快速、高效及批量化功能验证，促进桑树基础研究的快速发展。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]本专利技术提供了一种基于根癌农杆菌真空渗透介导的桑树离体瞬时转化方法，具体步骤为：
[0008]步骤1，将含有目的基因的根癌农杆菌摇菌培养后收集菌体，再用渗透缓冲液重悬得到农杆菌侵染液；其中，渗透缓冲液具体为：无菌双蒸水中含有10mM MES，10mM MgCl2，50～200μmol/L乙酰丁香酮(AS)，pH为5.6。
[0009]步骤2，先将桑树离体组织浸入渗透缓冲液中超声处理产生为微孔创伤，再将桑树离体组织浸入农杆菌侵染液中真空渗透侵染。
[0010]进一步地，在上述的桑树离体瞬时转化方法中，根癌农杆菌可以为农杆菌GV3101、农杆菌EHA105或农杆菌LBA4404；其中，农杆菌LBA4404的转化效率最佳。
[0011]进一步地，在上述的桑树离体瞬时转化方法中，农杆菌侵染液的OD
600
为0.5～1.0；优选OD
600
＝0.5。
[0012]进一步地，在上述的桑树离体瞬时转化方法中，步骤2用于浸染桑树离体组织的农杆菌浸染液中还含有Silwet L
‑
77表面活性剂，且其浓度优选为0.02％。
[0013]进一步地，在上述的桑树离体瞬时转化方法中，超声处理的条件可以为：50KHz超声波仪器中超声处理10
‑
30s，其中20s为最佳。
[0014]进一步地，在上述的桑树离体瞬时转化方法中，真空浸染的条件为：0.7MPa真空条件下渗透侵染20min。
[0015]进一步地，在上述的桑树离体瞬时转化方法中，当桑树离体组织为组培苗时，该方法还包括步骤3：将浸染后组培苗接种于继代培养基共培养，再将组培苗洗菌后接种至无菌继代培养基中继续培养，其中培养7d为最佳。
[0016]更进一步地，在本专利技术的具体实施例中，验证了桑树组培苗的基因型为
‘
台果2号
’
、
‘
药桑
’
、
‘
澳玉
’
和
‘
8632
’
时的转化效果，其中
‘
台果2号
’
为最佳。
[0017]更进一步地，组培苗所用的继代培养基为DKW+ZT 2.0mg/L+6
‑
BA2.0mg/L+IAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，且步骤3中组培苗的培养时间为4～10d。
[0018]本专利技术的有益效果为：本专利技术基于农杆菌真空渗透侵染法，结合超声波处理，克服了叶脉组织导致注射侵染效率低的难题，建立了快速、高通量的桑树离体瞬时转化体系，并从乙酰丁香酮浓度、农杆菌菌株类型、农杆菌菌液浓度、超声波处理时间和培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于根癌农杆菌真空渗透介导的桑树离体瞬时转化方法，其特征在于，具体为：步骤1，将含有目的基因的根癌农杆菌摇菌培养后收集菌体，再用渗透缓冲液重悬得到农杆菌侵染液；步骤2，先将桑树离体组织浸入渗透缓冲液中超声处理，再将桑树离体组织浸入农杆菌侵染液中真空渗透侵染；所述渗透缓冲液具体为：无菌双蒸水中含有10mM MES，10mM MgCl2，50～200μmol/L乙酰丁香酮；且pH 5.6。2.根据权利要求1所述基于根癌农杆菌介导的桑树离体瞬时转化方法，其特征在于，所述根癌农杆菌为农杆菌GV3101、农杆菌EHA105或农杆菌LBA4404。3.根据权利要求1所述基于根癌农杆菌介导的桑树离体瞬时转化方法，其特征在于，所述农杆菌侵染液的OD
600
为0.5～1.0。4.根据权利要求1所述基于根癌农杆菌介导的桑树离体瞬时转化方法，其特征在于，所述农杆菌侵染液含有Silwet L
‑
77表面活性剂。5.根据权利要求1所述基于根癌农杆菌介导的桑树离体瞬时转化方法，其特征在于，所述超声处理的条件为：50KHz，超声处理10～30s。6.根据权利要求1所述基于根癌农杆菌介导的桑树离体瞬...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫荣利，张娜，于翠，张成，董朝霞，朱志贤，李勇，李金鑫，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：