一种利用诱导型致死基因快速鉴定烟草单倍体的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用诱导型致死基因快速鉴定烟草单倍体的方法，包括：1）构建诱导型启动子启动致死基因的表达载体；2）利用表达载体转化烟草单倍体诱导系，得到致死基因单拷贝插入的纯合转基因单倍体诱导系；3）以致死基因单拷贝插入的纯合转基因单倍体诱导系作为父本，待诱导四倍体栽培烟草为母本，杂交收获F1代种子；4）将F1代种子在培养液中进行播种，待长出幼苗后加入化学诱导剂启动致死基因的表达，调查幼苗死亡情况，其中，未死亡的植株即为待诱导系植株的单倍体。相比于植株形态和种子形态鉴定方法，准确性更高；相比于染色体数目鉴定、解剖学鉴定和放射性鉴定方法，操作简单，成本低，可用于大规模单倍体筛选和鉴定工作。可用于大规模单倍体筛选和鉴定工作。可用于大规模单倍体筛选和鉴定工作。

【技术实现步骤摘要】
一种利用诱导型致死基因快速鉴定烟草单倍体的方法


[0001]本专利技术涉及一种利用诱导型致死基因快速鉴定烟草单倍体的方法，属于育种


技术介绍

[0002]烟草单倍体是具有配子数目染色体，仅由原染色体组一半的染色体组数所构成的烟草个体。育种工作者常用花药离体培养、远缘杂交等方法来获得单倍体植株。烟草杂交育种通常需要5
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6代，通过诱导单倍体后加倍的方法可在2代内得到纯合的品系，在育种上至少能够缩短3
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4代的时间。在单倍体育种过程中进行早期筛选，可大大节约了育种的时间和成本。
[0003]在单倍体产生过程中常常伴随着多种杂株的出现，如花药培养和雌核培养易受到花药壁细胞、花芽体细胞、子房体细胞等干扰；远缘杂交、辐射花粉诱导、诱导系诱导等方法产生的单倍体中往往含有自交或杂交植株。如不及时去除杂株，将会大大降低单倍体的纯度。快速、准确鉴别单倍体是单倍体育种技术的关键环节。
[0004]目前烟草中常用的单倍体鉴定方法主要有表型鉴定、流式细胞仪法、染色体计数等，但表型鉴定方法存在准确率低，易受环境因素影响。流式细胞仪法、染色体计数操作繁琐、效率较低、对样品质量要求较高等问题。限制了鉴定方法的推广应用。

技术实现思路

[0005]基于上述，本专利技术提供一种利用诱导型致死基因快速鉴定烟草单倍体的方法，以克服现有技术的不足。
[0006]本专利技术的技术方案是：一种利用诱导型致死基因快速鉴定烟草单倍体的方法，包括以下步骤：
[0007]1)构建诱导型启动子启动致死基因的表达载体；
[0008]2)利用表达载体转化烟草单倍体诱导系，得到致死基因单拷贝插入的纯合转基因单倍体诱导系；
[0009]3)以致死基因单拷贝插入的纯合转基因单倍体诱导系作为父本，待诱导四倍体栽培烟草为母本，杂交收获F1代种子；
[0010]4)将F1代种子在无菌水中萌发，长出幼苗后喷施化学诱导剂启动致死基因的表达，调查幼苗死亡情况，其中，未死亡的植株即为待诱导植株的单倍体。
[0011]可选的，所述致死基因包括白喉毒素A链、蓖麻毒素基因酶亚基a、铜绿假单胞菌外毒素A、米曲霉基因RNase
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T1或Barnase。
[0012]可选的，所述步骤1)的方法为，利用含有诱导型启动子的pTA7002载体，将致死基因构建到载体上，得到pTA7002：致死基因载体。
[0013]可选的，所述步骤2)的方法为，将构建好的pTA7002：致死基因载体转化农杆菌GV3101，通过叶盘法转化烟草单倍体诱导系，在潮霉素抗性MS培养基上筛选抗性芽，进行诱
导生根，筛选阳性植株进行southern blot实验，选择单拷贝插入的T0代株系进行套袋留种，将T1代播种后进行PCR检测，选取转基因阳性株系进行套袋留种，将T2代播种后进行PCR检测，选取转基因阳性的纯合株系作为致死基因单拷贝插入的纯合转基因单倍体诱导系。
[0014]可选的，所述烟草单倍体诱导系的获取方法为，在栽培烟草中对单倍体诱导基因NtDMP1、NtDMP2和NtDMP3进行基因编辑，获得NtDMP1基因、NtDMP2基因和NtDMP3基因同时编辑失活的纯合株系即为烟草单倍体诱导系。
[0015]可选的，F1代种子在无菌水中播种后20天，对幼苗喷施化学诱导剂，7天后调查幼苗死亡情况。
[0016]可选的，所述化学诱导剂包括地塞米松或对香豆酸或β
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雌二醇。
[0017]本专利技术的有益效果是：本专利技术方法所用的致死基因由诱导型启动子启动，单拷贝纯合转基因株系与普通栽培烟草的杂交后代为致死基因单拷贝插入杂合植株，在化学诱导剂诱导下死亡，而单倍体植株中不含致死基因，在化学诱导剂诱导下可正常生长。相比于植株形态和种子形态鉴定方法，准确性更高；相比于染色体数目鉴定、解剖学鉴定和放射性鉴定方法，操作简单，成本低，可用于大规模单倍体筛选和鉴定工作。
附图说明
[0018]图1为喷施地塞米松后7天幼苗死亡情况；
[0019]图2为死亡植株的根和未死亡植株的叶片的染色体数目分析。
具体实施方式
[0020]为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似改进，因此本专利技术不受下面公开的具体实施的限制。
[0021]实施例1：栽培烟草单倍体诱导系的获得
[0022]1、靶标基因序列信息
[0023]栽培烟草单倍体候选基因NtDMP1，NtDMP2和NtDMP3的靶标序列信息分为如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示：
[0024]SEQ ID NO.1：
[0025]GAATTGCCTCAACCAGCAATTGGTGGCAAGAAAAGACGAGCAATGGCAAATGGGGTTCAAAAAACACTCTCAAAAACTTCATTGCTTGTCAATTTCTTGCCAACAGGCACACTTTTAACTTTTGAAATGGTCCTTCCATCAGTCTATGGCAAAGGCGATTGTTCCCCTGTCACTACACTAATGATTTTAACACTACTTGGCCTTTGTACTTTGTCTTGCTTCTTCTTCCATTTTACCGATAGTTTTCGGGGACCCGACGGGAAAGTTTACTATGGATTTGTGACACCAAGAG
[0026]SEQ ID NO.2：
[0027]GAATTGCCTCAACCAGCAATTGGTGGCAAAAAAAGAAGAGCAATGGCTAATGGGGTTCAAAAAACTCTCTCAAAAACTTCATTGCTTGTCAATTTTCTACCAACAGGCACACTTCTAACTTTTGAAATGGTCCTTCCATCAGTCTATGGCAAAGGCGATTGTTCACCGGTCACTACATTAATGATTTTAACACTACTTGGCCTTTGTACTTTGTCTTGCTTCTTCTTCCATTTTACCGATAGTTTTCGTGGACCCGATGGGAAAGTTTACTATGGATTTGTGACACCAAGAGG
[0028]SEQ ID NO.3：
[0029]GAATTGCCTCAACCAGCAATTGGTGGCAAAAAAAGAAGAGCAATGGCAAATGGGATTCAAAAAACTCTCTCAAAAACTTCATTGCTTGTCAATTTTCTACCAACAGGCACACTTCTAACTTTTGAAATGGTCCTTCCATCAGTCTATGGCAAAGGCGATTGTTCACCCGTCACTACATTAATGATTTTAACACTACTTGGCCTTTGTACTTT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用诱导型致死基因快速鉴定烟草单倍体的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建诱导型启动子启动致死基因的表达载体；2)利用表达载体转化烟草单倍体诱导系，得到致死基因单拷贝插入的纯合转基因单倍体诱导系；3)以致死基因单拷贝插入的纯合转基因单倍体诱导系作为父本，待诱导四倍体栽培烟草为母本，杂交收获F1代种子；4)将F1代种子在无菌水中萌发，长出幼苗后喷施化学诱导剂启动致死基因的表达，调查幼苗死亡情况，其中，未死亡的植株即为待诱导植株的单倍体。2.根据权利要求1所述的利用诱导型致死基因快速鉴定烟草单倍体的方法，其特征在于，所述致死基因包括白喉毒素A链、蓖麻毒素基因酶亚基a、铜绿假单胞菌外毒素A、米曲霉基因RNase
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T1或Barnase。3.根据权利要求2所述的利用诱导型致死基因快速鉴定烟草单倍体的方法，其特征在于，所述步骤1)的方法为，利用含有诱导型启动子的pTA7002载体，将致死基因构建到载体上，得到pTA7002：致死基因载体。4.根据权利要求3所述的利...

【专利技术属性】
技术研发人员：张孝廉，张莉莉，王丰，张吉顺，曹领改，贾蒙骜，余世州，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：