一种侵染液及香樟瞬时转化方法技术

本发明专利技术公开了一种侵染液及香樟瞬时转化方法，涉及香樟瞬时转化技术领域，一种香樟瞬时转化方法，其特征在于：所述香樟瞬时转化方法包括香樟培养，取香樟叶片；所述香樟叶片清洗后采用上述侵染液进行叶片侵染。农杆菌在不同生长时期的活力状态存在明显差异，将扩增后的处于不同生长时期的菌液进行离心，并用溶菌液调整侵染液浓度。在侵染香樟叶片后，置于培养箱中进行共培养，通过测定Ca

【技术实现步骤摘要】
一种侵染液及香樟瞬时转化方法


[0001]本专利技术涉及香樟瞬时转化
，具体涉及一种侵染液及香樟瞬时转化方法。

技术介绍

[0002]香樟是亚热带地区优良的常绿阔叶乔木，其不仅可作为行道树和园林绿化树种，还具有药用、材用、提取香精等多种经济用途。目前，香樟的再生体系已初步建立，然而其分子领域研究进展却非常缓慢。虽然已有关于农杆菌侵染香樟愈伤组织的研究报道，但是其存在稳定性差、转化系统冗长耗时等诸多问题。因此，目前尚未建立起成熟、高效的香樟遗传转化体系。这就限制了从分子生物学角度深入揭示香樟诸多优良性状的形成机制并鉴定相关功能基因，以及从分子育种角度对香樟进行改良以提升其药用成分和香精成分含量并扩大其生态适应性。
[0003]瞬时转化技术是指将目的基因导入到受体细胞中以建立暂时性的高效表达体系，从而在相对较短时间内使目的基因大量表达的技术。利用植物瞬时技术表达重组蛋白时，所转化的基因无需整合到植物基因组中，从而节省了遗传转化和筛选等冗长过程，并可在短期内便实现目标蛋白表达。故与稳定表达相比，瞬时转化具有简单、快速、周期短、效率高、生物安全性强等特点。
[0004]基于香樟的遗传转化现状与瞬时转化技术优势，本专利技术提供一种侵染液及香樟瞬时转化方法。

技术实现思路

[0005](一)解决的技术问题
[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种侵染液及香樟瞬时转化方法，解决
技术介绍
中提出的至少一个技术问题。
[0007](二)技术方案
[0008]本专利技术采用的技术方案是：
[0009]一方面，本专利技术提供一种侵染液，所述的制备方法包括：
[0010]将带有Ca
2+
荧光指示蛋白基因的农杆菌GV3101在含有卡那霉素、利福平和链霉素的LB平板上划线复壮；
[0011]挑取单菌落于含有卡那霉素、利福平和链霉素的LB液体培养基中活化至菌液出现浑浊；
[0012]吸取菌液于培养基中扩增至OD
600
为0.3
‑
1.1；
[0013]经离心后收集菌体，用含有蔗糖、Silwet
‑
77和MES溶菌液将菌体溶解至侵染浓度。
[0014]优选的，所述LB平板含有50mg
·
L
‑1卡那霉素、25mg
·
L
‑1利福平和25mg
·
L
‑1链霉素。
[0015]优选的，所述离心为经4000
‑
6000rpm离心10
‑
15min。
[0016]优选的，单菌落于LB液体培养基中活化18h至菌液出现浑浊。
[0017]优选的，所述蔗糖的添加量为5g
·
L
‑1、Silwet
‑
77的添加量为0.04％和MES溶菌液的添加量为0.1M，且所述MES溶菌液的pH为5.7。
[0018]另一方面，本专利技术还提供一种香樟瞬时转化方法，所述香樟瞬时转化方法包括：
[0019]采用上述侵染液；
[0020]香樟培养，取香樟叶片；
[0021]所述香樟叶片清洗后采用上述侵染液进行叶片侵染并共培养。
[0022]优选的，叶片侵染的方式为注射侵染或浸泡侵染。
[0023]优选的，吸取菌液于培养基中扩增至OD
600
为0.5
‑
0.7。
[0024]优选的，侵染液的浓度OD
600
为0.7
‑
0.8。
[0025]优选的，共培养时间为24
‑
48h。
[0026](三)有益效果
[0027]本专利技术提供了一种侵染液及香樟瞬时转化方法，与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0028]1、本专利技术实施例提供的侵染液及香樟瞬时转化方法，农杆菌在不同生长时期的活力状态存在明显差异，将扩增后的处于不同生长时期的菌液进行离心，并用溶菌液调整侵染液浓度。在侵染香樟叶片后，置于培养箱中进行共培养，通过测定Ca
2+
荧光强度，明确了适合香樟的侵染方式、农杆菌状态、侵染液浓度、共培养时间等关键技术，对促进香樟分子生物学研究与分子育种的顺利开展具有重要价值。
附图说明
[0029]下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步说明：
[0030]图1侵染前后对比图。注：A:未处理；B:划痕；C:注射侵染；D:浸泡侵染；
[0031]图2不同侵染方式下香樟叶片的荧光图像。注：A:注射侵染；B:浸泡侵染；
[0032]图3不同侵染方式下香樟叶片的荧光强度。注：不同小写字母代表在P<0.05水平上差异显著；
[0033]图4香樟叶片在不同共培养时间下的荧光图像。注：A:未侵染；B:侵染12h；C:侵染24h；D:侵染48h；E:侵染60h；F:侵染72h。
[0034]图5香樟叶片在不同共培养时间下的荧光强度。注：不同小写字母代表在P<0.05水平上差异显著；
[0035]图6不同浓度侵染液侵染香樟后的叶片荧光强度。注：不同小写字母代表在P<0.05水平上差异显著；
[0036]图7不同状态的农杆菌侵染香樟叶片后的荧光强度。注：不同小写字母代表在P<0.05水平上差异显著；
[0037]图8高温胁迫下香樟叶片Ca
2+
荧光图像；
[0038]图9高温胁迫下香樟叶片Ca
2+
荧光强度。注：不同小写字母代表在P<0.05水平上差异显著。
[0039]具体实施方法
[0040]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的
实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0041]为了更好的理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明：
[0042]第一方面，本专利技术实施例提供一种侵染液，所述的制备方法包括：
[0043]将带有Ca
2+
荧光指示蛋白基因的农杆菌GV3101在含有卡那霉素、利福平和链霉素的LB平板上划线复壮；
[0044]挑取单菌落于含有卡那霉素、利福平和链霉素的LB液体培养基中活化至菌液出现浑浊；
[0045]吸取菌液于培养基中扩增至OD
600
为0.3
‑
1.1；
[0046]经离心后收集菌体，用含有蔗糖、Silwet
‑
77和MES溶菌液将菌体溶解至侵染浓度。
[0047]第一方面，本专利技术实施例还提供一种香樟瞬时转化方法，所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种侵染液，其特征在于，所述的制备方法包括：将带有Ca
2+
荧光指示蛋白基因的农杆菌GV3101在含有卡那霉素、利福平和链霉素的LB平板上划线复壮；挑取单菌落于含有卡那霉素、利福平和链霉素的LB液体培养基中活化至菌液出现浑浊；吸取菌液于培养基中扩增至OD
600
为0.3
‑
1.1；经离心后收集菌体，用含有蔗糖、Silwet
‑
77和MES溶菌液将菌体溶解至侵染浓度。2.根据权利要求1所述的侵染液，其特征在于：所述LB平板含有50mg
·
L
‑1卡那霉素、25mg
·
L
‑1利福平和25mg
·
L
‑1链霉素。3.根据权利要求1所述的侵染液，其特征在于：所述离心为经4000
‑
6000rpm离心10
‑
15min。4.据权利要求1所述的侵染液，其特征在于：单菌落于LB液体培养基中活化18h至菌液...

【专利技术属性】
技术研发人员：左照江，张思怡，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：