本发明专利技术公开了一种夜来香花叶病毒(TelMV)侵染性克隆及其构建方法，将SEQIDNo：1分成N1、N2、M和C四段，扩增得到四个片段，克隆到同一个植物表达载体中，得到重组表达载体。本发明专利技术构建了TelMV侵染性全长cDNA克隆，能够成功侵染实验寄主本氏烟，并实现对自然宿主百香果的侵染。本发明专利技术能够快速、高效的构建出TelMV的侵染性克隆，有利于后续探究TelMV的生物学特性、致病机制和与寄主之间的相互作用，为日后防治相关病害提供理论依据。关病害提供理论依据。关病害提供理论依据。
【技术实现步骤摘要】
一种TelMV侵染性克隆及其构建方法
[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种TelMV侵染性克隆及其构建方法。
技术介绍
[0002]植物病毒根据其基因组的差异可分为DNA病毒和RNA病毒，并且迄今为止发现的大多 数植物病毒都是RNA病毒。在关于植物病毒的研究中，病毒的致病机理和病毒与寄主之间的 相互作用关系一直是研究的重点，但由于目前相关的分子生物学技术主要以DNA为主，这使 得对RNA病毒相关生物学特性的研究受到了极大的限制。因此，作为RNA病毒研究中的反 向遗传学工具，侵染性cDNA克隆使得人们能够在DNA水平上对RNA病毒进行遗传操作， 在研究RNA病毒中具有重要的意义。侵染性cDNA克隆主要是指包含病毒全部基因组的具有 侵染性的cDNA或cDNA的体外转录产物(Boyer et al.，1994)，其中侵染性的cDNA是指将 病毒基因组的全长双链cDNA整合到植物双元表达载体内的35S启动子下游区域，该启动子 是植物的强启动子，来源于花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)，通过农杆菌介导 转染寄主植物后，启动病毒cDNA的转录，从而表达出病毒基因组的正义RNA全长序列。通 过这种方法，在1984年首先成功构建出雀麦花叶病毒(Brome mosaic virus,BMV)的侵染性 cDNA克隆(Ahlquist et al.,1984)。近些年来，已有多种植物RNA病毒的侵染性cDNA克隆 被成功构建出来(Dawson et al.,1986；Flatken et al.,2008；Vives et al.,2008；Cui et al.,2013； Carvalho et al.,2017；Hu et al.,2020)。
[0003]夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus,TelMV)属于马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属， 为正义单链RNA病毒，具有典型的马铃薯Y病毒属病毒的特征(Ha et al.,2008)。其基因组大 小约为9.6kb
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10kb，病毒粒子形态呈弯曲线状。该病毒最早是在越南的夜来香上被鉴定到，随 后在泰国发现该病毒可以侵染百香果(Chiemsombat et al.,2014)。目前，在多个百香果种植区 域均有TelMV侵染百香果的相关报道，且都具有较高的检出率。因此，对TelMV在百香果上 的致病机制、发生规律、流行传播以及防控技术的研究显得尤为重要。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种TelMV侵染性克隆及其构建方法。
[0005]本专利技术的第一个方面是提供一种夜来香花叶病毒侵染性全长cDNA克隆的构建方法，包括 以下步骤：
[0006](1)所述夜来香花叶病毒的基因组全长cDNA序列如序列表中SEQ ID No：1所示，将 夜来香花叶病毒的基因组分成N1、N2、M和C四段，N1段为香花叶病毒的基因组全长cDNA 的第1
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2136位，N2段为香花叶病毒的基因组全长cDNA的第2137
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4493位，M段为香花叶病 毒的基因组全长cDNA的第4494
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6033位，C段为香花叶病毒的基因组全长cDNA的第 6034
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10050位；
[0007](2)以夜来香花叶病毒的cDNA为模板扩增所述N1段、N2段、M段和C段；
[0008](3)将四个片段克隆到同一个植物表达载体中，得到重组表达载体。
[0009]优选地，在扩增N1段的正向引物5
’
端做磷酸化修饰，扩增C段的反向引物5
’
端引入MluI 酶切位点，在植物表达载体上引入StuI、SalI、BamHI、SpeI和MluI多克隆位点，通过酶切连 接将四个片段克隆到植物表达载体中，得到重组表达载体。
[0010]优选地，扩增N1段的引物对为N1
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F：TAAATTAAAACAACTCGGCAAGAC和N1
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R： TGAGTGTCGACCTCTTTCACCC。
[0011]优选地，扩增N2段引物对为N2
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F：AAGAGGTCGACACTCAAAAAGGT和N2
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R： TTGCTGGATCCAAACTTACTCAAA。
[0012]优选地，扩增M段的引物对为M
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F：AGTTTGGATCCAGCAACATCAC和M
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R： GCATCACTAGTGAACTTCACAC。
[0013]优选地，扩增C段的引物对为C
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F：AGTTCACTAGTGATGCCTTACTAG和C
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R： ATATAACGCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGGACAACAAACATTAAGGCAGAT。
[0014]本专利技术中，不对植物表达载体进行具体限制，本领域技术人员进行合理选择即可。在本发 明的一个具体实施方式中，所述植物表达载体为pCB301载体，在pCB301载体载体上引入StuI、 SalI、BamHI、SpeI和MluI多克隆位点，通过酶切连接将N1、N2、M和C四个片段克隆到 植物表达载体中，得到TelMV侵染性全长cDNA克隆。优选地，所述植物表达载体为PCB301 载体。
[0015]优选地，采用引物对PCB
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F： ATATAACTAGTAAAACGCGTGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAA和PCB
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R：ATATAGGATCCTTTGTCGACTTTAGGCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC进行扩增，在 PCB301载体载体上引入StuI、SalI、BamHI、SpeI和MluI多克隆位点。
[0016]优选地，步骤(3)中先将M段克隆到植物表达载体中，再将N1与C段克隆到植物表达 载体中，最后将N2段克隆到植物表达载体中。
[0017]进一步优选地，步骤(3)中先将M段克隆到植物表达载体中，再将N1克隆到植物表达 载体中，然后将C段克隆到植物表达载体中，最后将N2段克隆到植物表达载体中。
[0018]本专利技术的第二个方面是提供利用本专利技术第一个方面所述的构建方法所构建的夜来香花叶 病毒侵染性全长cDNA克隆。
[0019]本专利技术的第三个方面是提供含有本专利技术第二个方面所述的夜来香花叶病毒侵染性全长 cDNA克隆的重组菌。
[0020]优选地，所述重组菌为含有所述夜来香花叶病毒侵染性全长cDNA克隆的农杆菌。
[0021]本专利技术的第四个方面是提供本专利技术第二个方面所述的夜来香花叶病毒侵染性全长cDNA 克隆、或者本专利技术第三个方面所述的重组菌在制备单一病毒侵染植物模型中的应用；所述单一 病毒为夜来香花叶病毒。
[0022]本专利技术的第五个方面是提供本专利技术第二个方面所述的夜来香本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种夜来香花叶病毒侵染性全长cDNA克隆的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)所述夜来香花叶病毒的基因组全长cDNA序列如序列表中SEQ ID No：1所示，将夜来香花叶病毒的基因组分成N1、N2、M和C四段，N1段为香花叶病毒的基因组全长cDNA的第1
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2136位，N2段为香花叶病毒的基因组全长cDNA的第2137
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4493位，M段为香花叶病毒的基因组全长cDNA的第4494
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6033位，C段为香花叶病毒的基因组全长cDNA的第6034
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10050位；(2)以夜来香花叶病毒的cDNA为模板扩增所述N1段、N2段、M段和C段；(3)将四个片段克隆到同一个植物表达载体中，得到重组表达载体。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在扩增N1段的正向引物5
’
端做磷酸化修饰，扩增C段的反向引物5
’
端引入MluI酶切位点，在植物表达载体上引入StuI、SalI、BamHI、SpeI和MluI多克隆位点，通过酶切连接将四个片段克隆到植物表达载体中，得到重组表达载体。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，扩增N1段的引物对为N1
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F：TAAATTAAAACAACTCGGCAAGAC和N1
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R：TGAGTGTCGACCTCTTTCACCC；扩增N2段引物对为N2
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F：AAGAGGTCGACACTCAAAAAGGT和N2
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R：TTGCTGGATCCAAACTTACTCAAA；扩增M段的引物对为M
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F：AGTTTGGATCCAGCAACATCAC和M
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R：GCATCACTAGT...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔红光，苟贝，冉闽媛，戴兆基，房传营，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：
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