一种CRISPR-Cas3系统及其在抗植物病毒方面的应用技术方案

本发明专利技术公开了提高植物病毒抗性的方法，包括利用CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种CRISPR
‑
Cas3系统及其在抗植物病毒方面的应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及CRISPR
‑
Cas3系统及其在抗植物病毒方面的应用。

技术介绍

[0002]CRISPR
‑
Cas系统指RNA指导的防御外源噬菌体或病毒入侵的一种适应性免疫系统，可分为两大类(class 1和class 2)，及六个型(type I
–
type
Ⅵ
)。目前，П型CRISPR
‑
Cas9系统的应用最为广泛，可以用于植物基因编辑和调控。实际上，1类I型是自然界中分布最广的类型，它们是通过多个Cas蛋白形成级联复合物来发挥功能的，其核酸内切酶被称为Cas3，能够以逐渐降解的方式对靶DNA进行大片段的删除。最近报道了I型CRISPR
‑
Cas3系统在真核生物基因编辑方面的应用，在动物细胞和植物细胞中造成了一系列基因组DNA成百上千碱基对的大片段删除。
[0003]植物病毒是仅次于真菌的第二严重危害植物的病原，在全世界广泛流行和爆发，每年造成上千亿美元的损失。由于病毒经常在植物上复合侵染，且经常发生重组与突变，给治疗和防控带来了更大的困难。虽然，CRISPR
‑
Cas9能够用于赋予植物对病毒的抗性，但是仍然无法克服病毒因重组和突变产生的免疫逃逸。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是如何提高植物对病毒的抗性，如双生病毒科病毒。/>[0005]本专利技术提供一种提高植物病毒抗性的方法，包括利用CRISPR
‑
Cas3系统来提高植物对病毒的抗性，所述CRISPR
‑
Cas3系统包括表达Cas蛋白和表达靶向病毒基因的crRNA的重组表达载体，所述Cas蛋白由Cas3蛋白、Cas5蛋白、Cas6蛋白、Cas7蛋白和Cas8蛋白组成。
[0006]所述CRISPR
‑
Cas3系统可为1类(class 1)I
‑
B亚型。
[0007]进一步地，所述病毒可为DNA病毒。
[0008]进一步地，所述DNA病毒可为双链DNA病毒和/或单链DNA病毒。
[0009]进一步地，所述DNA病毒可为双生病毒科病毒。
[0010]进一步地，所述双生病毒科病毒可为下述5种、4种、3种、2种或1种病毒：
[0011]V2)、木薯花叶病毒；
[0012]V3)、斯里兰卡木薯花叶病毒；
[0013]V4)、印度木薯花叶病毒；
[0014]V5)、番茄黄叶卷曲病毒；
[0015]V6)、泽兰黄脉病毒。
[0016]上述方法中，所述植物可为双子叶植物和/或单子叶植物。
[0017]进一步地，所述双子叶植物可为烟草。
[0018]进一步地，所述烟草可为本氏烟草。
[0019]如上所述的方法中，所述crRNA的靶标序列如SEQ ID No.7所示。所述靶标对应的
crRNA是核苷酸序列为5
’‑
AGAUCCAAAAGCGGCCAUCCGUAUAAUAUUACCGGAU
‑3’
的单链RNA。
[0020]进一步地，所述靶标序列的上游是5
’‑
TTG
‑3’
或5
’‑
TCG
‑3’
或5
’‑
TCA
‑3’
的PAM序列；
[0021]进一步地，上述方法中：
[0022]所述Cas3蛋白可选自下述任一种蛋白质：
[0023]A1)、氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的蛋白质；
[0024]A2)、将A1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有Cas3蛋白活性的蛋白质；
[0025]A3)、在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；
[0026]所述Cas5蛋白可选自下述任一种蛋白质：
[0027]B1)、氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的蛋白质；
[0028]B2)、将B1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有Cas5蛋白活性的蛋白质；
[0029]B3)、在B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；
[0030]所述Cas6蛋白可选自下述任一种蛋白质：
[0031]C1)、氨基酸序列如SEQ ID No.10所示的蛋白质；
[0032]C2)、将C1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有Cas6蛋白活性的蛋白质；
[0033]C3)、在C1)或C2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；
[0034]所述Cas7蛋白可选自下述任一种蛋白质：
[0035]D1)、氨基酸序列如SEQ ID No.11所示的蛋白质；
[0036]D2)、将D1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有Cas7蛋白活性的蛋白质；
[0037]D3)、在D1)或D2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；
[0038]所述Cas8蛋白可选自下述任一种蛋白质：
[0039]E1)、氨基酸序列如SEQ ID No.12所示的蛋白质；
[0040]E2)、将E1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与E1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有Cas8蛋白活性的蛋白质；
[0041]E3)、在E1)或E2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
[0042]上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0043]上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein
‑
tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
[0044]上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.提高植物对病毒抗性的方法，包括利用CRISPR
‑
Cas3系统来提高植物对病毒的抗性，所述CRISPR
‑
Cas3系统包括表达Cas蛋白和表达靶向病毒基因的crRNA的重组表达载体，所述Cas蛋白由Cas3蛋白、Cas5蛋白、Cas6蛋白、Cas7蛋白和Cas8蛋白组成。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒为DNA病毒。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述DNA病毒为双链DNA病毒和/或单链DNA病毒。4.如权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述crRNA的靶标序列如SEQ ID No.7所示。5.如权利要求1
‑
4中任一所述的方法，其特征在于，所述Cas3蛋白选自下述任一种蛋白质：A1)、氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的蛋白质；A2)、将A1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有Cas3蛋白活性的蛋白质；A3)、在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；所述Cas5蛋白选自下述任一种蛋白质：B1)、氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的蛋白质；B2)、将B1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有Cas5蛋白活性的蛋白质；B3)、在B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；所述Cas6蛋白选自下述任一种蛋白质：C1)、氨基酸序列如SEQ ID No.10所示的蛋白质；C2)、将C1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有Cas6蛋白活性的蛋白质；C3)、在C1)或C2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；所述Cas7蛋白选自下述任一种蛋白质：D1)、氨基酸序列如SEQ ID No.11所示的蛋白质；D2)、将D1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有Cas7蛋白活性的蛋白质；D3)、在D1)或D2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；所述Cas8蛋白选自下述任一种蛋白质：E1)、氨基酸序列如SEQ ID No.12所示的蛋白质；E2)、将E1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与E1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有Cas8蛋白活性的蛋白质；E3)、在E1)或E2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。6.如权利要求1
‑
5中任一所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体由表达所述Cas3蛋白的载体、表达所述Cas5蛋白的载体、表达所述Cas6蛋白的载体、表达所述Cas7蛋白的载体、表达所述Cas8蛋白的载体和表达所述crRNA的载体组成。7.提高植物病毒抗性的CRISPR
‑
Cas3系统，其特征在于，所述CRISPR
‑
Cas3系统为权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶健，尹策策，徐爽，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：