【技术实现步骤摘要】
本申请涉及果桑资源鉴定，尤其涉及基于kasp技术开发的果桑抗菌核病snp分子标记及其应用。
技术介绍
1、桑树是一种重要的经济树种，在我国有5000多年栽培历史。桑树果实即桑椹不仅甘甜多汁、口味独特、鲜美更重要的是营养十分丰富，含有丰富的糖、酸和多种维生素、氨基酸、微量元素等矿物质、黄酮类等，尤其是硒的含量为百果之首，具有促进造血细胞生长、降血糖、降血脂等药理作用，被原卫生部列为“既是食品又是药品”名单。桑椹除直接食用外，目前已开发出果汁饮品、桑果酒、桑果酱、桑椹膏及花青素等产品，市场前景广阔。我国已收集保存了果桑资源200多份，绝大部分属广东桑和白桑。迄今已选育出了粤椹大十、穗果2号、红果1号、嘉陵30号、嘉陵40号等果用桑品种，然而桑椹菌核病却成为限制果桑产业发展的瓶颈问题。桑椹菌核病来势猛、发病快，在美国、欧洲、韩国、日本以及中国长江流域、珠江流域及西部地区等果桑种植区普遍发生，发病率高达30％～90％，有些地方成千亩果桑园因病害导致绝产，给果桑产业造成毁灭性危害，粤椹大十是目前生产上种植面积最大的品种，其也最易遭受桑椹菌核病威胁的果桑品种。因此，培育抗菌核病果桑新品种是目前解决产业发展问题最有效、最经济的手段。
2、桑树品种的选育主要是通过选择育种，杂交育种和诱变育种三种途径。选择育种只能从地方品种或自然变异，选出优良个体，不能有目的地创新。诱变育种目前还存在诱发变异不能定向控制，有利突变率不高，必须通过大量选择等问题。杂交育种仍是桑树育种应用最为广泛而有效的途径，由于果桑杂交后代，从播种到选择抗病单株周期长
3、根据技术发展水平，dna分子标记可划分为三代。第一代分子标记为基于southern杂交技术的rflp(限制性片段长度多态性)标记，第一代分子标记技术操作繁琐，检测周期长，成本高，成功率低；第二代分子标记主要是基于pcr技术为核心发展出的rapd(随机扩增多态性)、aflp(扩增片段长度多态性)、ssr(简单序列重复)、scar(特征序列扩增区域)和issr(内部序列重复)等标记，第二分子标记技术涉及传统凝胶电泳步骤相对繁琐，实验重复性差，容易产生假阳性带，要获得好的重复性须严格控制实验条件，且低通量；第三代分子标记主要是snp(单核苷酸多态性)，具备通量高、准确性高、数据易整合等优势，已经成为分子辅助育种、品种鉴定的主要技术方法。
4、目前国内外针对果桑菌核病抗病基因挖掘及其紧密连锁分子标记的开发还未见报道，抗病机制仍不是很清晰。
技术实现思路
1、竞争性等位基因特异性pcr(competitive allele specific pcr，kasp)技术是一种荧光检测的基因分型技术，该技术基于引物末端碱基的特异匹配来对snp分型以及检测基因序列发生的插入或缺失改变(indels)，该检测技术可以用2个荧光探针，2个通用淬灭探针，再加多个位点特异探针来检测多个snp位点，技术操作简单，分析稳定、准确，并且成本较低，易于实现高通量和自动化。
2、针对现有技术问题，本申请的目的是提供一种果桑抗菌核病snp分子标记，并利用该标记用于抗菌核病果桑品种的育种。
3、本申请人前期研究分析了高抗和高感果桑品种响应桑椹菌核病菌侵染的转录组测序数据，以及高抗和高感桑树品种响应桑椹炭疽菌侵染的转录组测序数据，发现一些基因对两种病害均有响应。通过对响应两种病害的基因进行病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing，vigs)和瞬时过表达进行功能验证发现，这些基因具有抗菌核病和炭疽病的功能。在此基础上，本申请实施例利用kasp分子标记技术对果桑资源或育种组合抗菌核病基因位点进行的鉴别，实现抗菌核病分子设计育种，有利于特定基因的转育和聚合，加快抗性品种的选育进度，避免传统育种中的盲目性，节省育种成本，提高育种选择的准确性和效率，具有重要应用意义。
4、基于此，本申请提供了如下技术方案：
5、第一方面，本申请实施例提供发一种与果桑抗菌核病相关的snp分子标记，所述snp分子标记包括白桑基因组第4号染色体的第18208100位碱基发生a>t单核苷酸突变的形成的核苷酸序列。
6、优选地，所述snp分子标记包括seq id no：1所示的核苷酸序列，在seq id no：1所示的核苷酸序列中，n为a或t。
7、更优选地，所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no：1所示，其中n为a或t。
8、第二方面，本申请实施例提供了一种用于扩增前述snp分子标记的引物组，该引物组为：
9、snp6-f1：核苷酸序列如seq id no：12所示；
10、snp6-f2：核苷酸序列如seq id no：13所示；
11、snp6-r：核苷酸序列如seq id no：14所示。
12、第三方面，本申请实施例提供了一种与果桑抗菌核病和/或炭疽病相关的核酸分子，所述核酸分子包括前述snp分子标记。
13、第四方面，本申请实施例提供了一种鉴别果桑抗菌核病或抗炭疽病的试剂盒，其包括前述引物组。
14、第五方面，本申请实施例提供了一种鉴别抗菌核病果桑和/或抗炭疽病果桑品种的方法，包括：
15、以待测果桑的dna为模板，采用前述引物组对其进行pcr扩增；直接通过荧光信号区分基因型及所述基因型与果桑品种的相关性，鉴别抗菌核病果桑和/或抗炭疽病果桑品种。
16、第六方面，本申请实施例提供了前述分子标记或前述引物组或前述试剂盒或前述方法在果桑育种中的应用。
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1.一种与果桑抗菌核病相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记包括白桑基因组第4号染色体的第18208100位碱基发生A>T单核苷酸突变的形成的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记包括SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中，N为A或T；可选地，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中N为A或T。
3.一种用于扩增权利要求1所述SNP分子标记的引物组，其特征在于，该引物组为：
4.一种与果桑抗菌核病和/或炭疽病相关的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括权利要求1所述SNP分子标记。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为ALE2基因片段，且所述核酸分子的核苷酸序列长度为5353-5453bp，其中，位于SEQ ID NO：1所示序列上游序列的长度为50-100bp，位于SEQ ID NO：1所示序列下游序列的长度为50-100bp；可选地，所述核酸分子为ALE2基因片段，所述核酸
6.一种鉴别果桑抗菌核病和/或炭疽病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述引物组。
7.一种鉴别抗菌核病果桑和/或抗炭疽病果桑品种的方法，其特征在于，所述方法包括：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述基因型包括AA基因型、AT基因型以及TT基因型，其中，所述AT基因型与所述TT基因型均同时为抗菌核病和抗炭疽病果桑品种。
9.权利要求1～2任一项所述分子标记或权利要求3所述引物组或权利要求4～5任一项所述核酸分子或权利要求6所述试剂盒或权利要求7～8任一项所述方法在果桑育种中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述果桑品种为抗菌核病果桑；可选地，所述果桑品种为抗炭疽病果桑；可选地，所述果桑品种为同时抗菌核病和抗炭疽病的果桑。
...【技术特征摘要】
1.一种与果桑抗菌核病相关的snp分子标记，其特征在于，所述snp分子标记包括白桑基因组第4号染色体的第18208100位碱基发生a>t单核苷酸突变的形成的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的snp分子标记，其特征在于，所述snp分子标记包括seq id no：1所示的核苷酸序列，在seq id no：1所示的核苷酸序列中，n为a或t；可选地，所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no：1所示，其中n为a或t。
3.一种用于扩增权利要求1所述snp分子标记的引物组，其特征在于，该引物组为：
4.一种与果桑抗菌核病和/或炭疽病相关的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括权利要求1所述snp分子标记。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为ale2基因片段，且所述核酸分子的核苷酸序列长度为5353-5453bp，其中，位于seq id no：1所示序列上游序列的长度为50-100bp，位于seq id no：1所示序列下游序列的长度为50-100bp；可选地，所述核酸分子为ale2基因片段，所述核酸分子的核苷...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱志贤，于翠，孙兵，张成，董朝霞，张凤，刘欣欣，胡兴明，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：
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