一种杧果胚性细胞的遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种杧果胚性细胞的遗传转化方法，包括以下步骤：(S1)取杧果果核中的胚轴组织接种至愈伤培养基中进行培养；(S2)将愈伤组织转移至液体增殖培养基中进行继代增殖培养，获得杧果胚性悬浮细胞；(S3)制备农杆菌重悬液；(S4)将杧果胚性悬浮细胞经预处理；(S5)将预处理杧果胚性悬浮细胞与农杆菌重悬液混合进行转化培养，将转化后的悬浮细胞先接种至Paul固体培养基中进行暗培养，再转移至含有潮霉素、头孢噻肟和植物凝胶的Murashige和Skoog培养基中进行选择培养，获得杧果胚性细胞遗传转化体系。该方法通过建立杧果胚性细胞培养系，用杧果胚性细胞为转化受体，建立高效及适应性广的杧果遗传转化体系。及适应性广的杧果遗传转化体系。及适应性广的杧果遗传转化体系。

【技术实现步骤摘要】
一种杧果胚性细胞的遗传转化方法


[0001]本专利技术属于植物组培
，具体涉及一种杧果胚性细胞的遗传转化方法。

技术介绍

[0002]杧果(Mangifera India L.)起源于古印度，生长在世界上大多数热带地区，是目前最重要的热带经济作物之一。杧果是漆树科(Anacardiaceae)杧果属(Mangifera)(英文名mango，中文又名芒果、檬果)，被誉为“热带果王”，仅次于柑橘、蕉类、葡萄、苹果，居世界水果第五位，我国杧果2019年种植面积32.3万hm2，居世界第三位。果实形态美观，色泽诱人，果肉质地细滑多汁，香味独特，风味浓郁，营养丰富，极受消费者欢迎。但是杧果树具有生命周期长、异花授粉、杂合性强等特点，利用常规育种进行改良难度较大。
[0003]杧果是世界上种植最广泛的热带果树之一，可是目前生产上栽培的许多杧果品种品质优良但抗病性较差。体细胞胚再生体系(somatic embryogenesis,SE)是杧果植株再生最为有效的再生途径(Krishna and Singh,2007)。也是利用生物技术开展杧果抗性分子育种的重要平台(Litz et al.,1991；Jayasankar and Litz,1998)。杧果的体细胞胚发生主要是通过间接发生途径，多是以珠心外植体脱分化诱导出愈伤组织，愈伤组织再分化诱导出原胚团，原胚团能增殖或发育形成早期体细胞胚(如球形胚，心形胚)，从而进一步发育为成熟体细胞胚(如子叶胚)(Litz et al.,1982；Litz,1984；Dewald et al.,1989；Krishna and Singh,2007；黄镜浩等,2009)。国外首次报道是1982年Litz R.E.对自然多胚杧果胚珠进行离体培养，获得了体细胞胚(Litz R.E.et al，1982)；1984年Litz R.E.又从自然多胚杧果Chino和Ono及几种单胚杧果的珠心细胞诱导出愈伤组织并进行多次继代培养诱导出体细胞胚，这一研究为再生杧果植株奠定了基础(Litz R E.et al,1984；Litz R E.et al,1984)。
[0004]近十几年来植物基因工程的研究进展十分迅速。在植物抗病、抗虫、抗除草剂贮存与保鲜和改变植物的某些成分方面都已得到了不少转基因植株，有的已经建成了品系，为提高作物的产量，抗逆能力，改进它们的品质，进行快速、优质、稳产的育种选育提供了一条诱人的全新途径。这些新技术能否在作物改良上成功利用，首先取决于能否建立适合基因转化的细胞悬浮系。杧果的细胞组织培养可以为杧果的转基因提供材料，并在此基础上实现了体细胞胚胎发生。作为当前应用最为广泛的技术和农杆菌遗传转化的主要载体，却由于品种的特异性使得该体系存在胚性愈伤诱导率和植株转化率低的问题。因此，建立成熟的ECS(胚性细胞悬浮系)和遗传转化体系在杧果品种的遗传改良中都具有重要的理论意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种杧果胚性细胞的遗传转化方法，该方法通过建立杧果胚性细胞培养系，用杧果胚性细胞为转化受体，建立高效及适应性广的杧果遗传转化体系。
[0006]本专利技术的上述目的可以通过以下技术方案来实现：一种杧果胚性细胞的遗传转化
方法，包括以下步骤：
[0007](S1)以未成熟的杧果果实作为外植体，将所述外植体消毒后取杧果果核中的胚组织接种至愈伤培养基中进行培养，获得愈伤组织；
[0008](S2)将愈伤组织转移至液体增殖培养基中进行继代增殖培养，获得杧果胚性悬浮细胞；
[0009](S3)将农杆菌在固体板上划线培养，挑取单菌落，接种至含有卡那霉素和利福平的LB液体培养基中进行活化培养，将活化好的菌液接种至LB液体培养基中培养后，离心，弃上清，加入含有乙酰丁香酮的Paul培养基重悬，得农杆菌重悬液；
[0010](S4)将步骤(S2)中的杧果胚性悬浮细胞用Paul培养基清洗，然后加入含有乙酰丁香酮的Paul培养基，混匀，得预处理杧果胚性悬浮细胞；
[0011](S5)将步骤(S4)中预处理杧果胚性悬浮细胞与步骤(S3)中农杆菌重悬液混合进行转化培养，将转化后的悬浮细胞先接种至Paul固体培养基中进行暗培养，然后再转移至含有潮霉素、头孢噻肟和植物凝胶的Murashige和Skoog培养基中进行选择培养，获得杧果胚性细胞遗传转化体系。
[0012]在该果胚性细胞的遗传转化方法中：
[0013]优选的，步骤(S1)中所述愈伤培养基为添加有0.5～3mg/L 2,4
‑
D、0.5～3mg/L玉米素，3.0％,w/w蔗糖和0.25％～0.30％,w/w植物凝胶的Murashige和Skoog固体培养基；培养条件为25～28℃、pH为5.8～5.9、黑暗，培养时间为40～60天。
[0014]优选的，步骤(S2)中所述液体增殖培养基为添加有2～3mg/L 2,4
‑
D、1～3mg/L玉米素、3.0～4.0％,w/w蔗糖的Murashige和Skoog液体培养基上进行培养；培养条件为25℃、pH为5.8～5.9、150～200rpm进行震荡黑暗培养，每5～7天继代一次。
[0015]本专利技术基于2,4
‑
D在建立胚性细胞系时发现，杧果的各个部位的外植体在产生伤口的时候很容易产生一种酚类物质的毒素，酚类物质产生过多会抑制细胞分化，并不是很容易将其培育出愈伤组织，因此，本申请在摸索培养基时发现了一种细胞分裂激素玉米素，玉米素是一类嘌呤类的植物细胞分裂素，它同时是植物内源性的一种植物生长调节剂，能够促进细胞分化，同时玉米素还具有防止逆转芽部受到毒素伤害的形成，具有抗衰老的功能，在二级学科上分为了激素与维生素，所以，玉米素不仅促进了杧果外植体的分化，同时也具有减少外植体在切口处产生多酚物质的毒素。
[0016]优选的，步骤(S3)中所述农杆菌为LBA4404。
[0017]优选的，步骤(S3)中所述卡那霉素的浓度为100～200mg/L，所述利福平的浓度为20～30mg/L。
[0018]优选的，步骤(S3)中培养条件为150～220rpm下震荡培养，培养条件为28～30℃、黑暗培养16～20小时。
[0019]优选的，步骤(S3)中将活化好的菌液接种至LB液体培养基中培养，培养条件为28～30℃，150～220rpm，震荡培养至OD600＝0.5～0.7。
[0020]优选的，步骤(S3)中离心时转速为8000rpm/min，离心时间为8～10分钟；所述乙酰丁香酮的加入量为10～20μL，浓度为50～100μmol/L。
[0021]优选的，步骤(S3)中～(S4)中所述Paul培养基为含有10％，w/w蔗糖的Murashige和Skoog培养基。
[0022]优选的，步骤(S4)中用800～1000mL含有10％，w/w蔗糖的Murashige和Skoog培养基(Paul培养基)清洗，每次用200～300mL，清本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种杧果胚性细胞的遗传转化方法，其特征是包括以下步骤：(S1)以未成熟的杧果果实作为外植体，将所述外植体消毒后取杧果果核中的胚轴组织接种至愈伤培养基中进行培养，获得愈伤组织；(S2)将愈伤组织转移至液体增殖培养基中进行继代增殖培养，获得杧果胚性悬浮细胞；(S3)将农杆菌在固体板上划线培养，挑取单菌落，接种至含有卡那霉素和利福平的LB液体培养基中进行活化培养，将活化好的菌液接种至LB液体培养基中培养后，离心，弃上清，加入含有乙酰丁香酮的Paul培养基重悬，得农杆菌重悬液；(S4)将步骤(S2)中的杧果胚性悬浮细胞用Paul培养基清洗，然后加入含有乙酰丁香酮的Paul培养基，混匀，得预处理杧果胚性悬浮细胞；(S5)将步骤(S4)中预处理杧果胚性悬浮细胞与步骤(S3)中农杆菌重悬液混合进行转化培养，将转化后的悬浮细胞先接种至Paul固体培养基中进行暗培养，然后再转移至含有潮霉素、头孢噻肟和植物凝胶的Murashige和Skoog培养基中进行选择培养，获得杧果胚性细胞遗传转化体系。2.根据权利要求1所述的杧果胚性细胞的遗传转化方法，其特征是：步骤(S1)中所述愈伤培养基为添加有0.5～3mg/L 2,4
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D、0.5～3mg/L玉米素，3.0％,w/w蔗糖和0.25％～0.30％,w/w植物凝胶的Murashige和Skoog固体培养基；培养条件为25～28℃、pH为5.8～5.9、黑暗，培养时间为40～60天。3.根据权利要求1所述的杧果胚性细胞的遗传转化方法，其特征是：步骤(S2)中所述液体增殖培养基为添加有2～3mg/L 2,4
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D、1～3mg/L玉米素、3.0～4.0％,w/w蔗糖的Murashige和Skoog液体培养基上进行培养；培养条件为25℃、pH为5.8～5.9、150～220rpm进行震荡黑暗培养，每5～7天继代一次。4.根据权利要求1所述的杧果胚性细胞的遗传转化方法，其特征是：步骤(S3)中所述农杆菌为LBA4404；步骤(S3)...

【专利技术属性】
技术研发人员：丛汉卿，王明珠，陈业渊，乔飞，霍婷，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，
类型：发明
国别省市：