黄花稔曲叶病毒侵染性克隆载体组合及其在制备模型植物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了黄花稔曲叶病毒侵染性克隆载体组合及其在制备模型植物中的应用。本发明专利技术提供了重组质粒组合，由重组质粒甲和重组质粒乙组成；所述重组质粒甲中具有SEQ ID NO：3所示的DNA分子；所述重组质粒乙中具有SEQ ID NO：4所示的DNA分子。本发明专利技术还提供了重组农杆菌组合，由将重组质粒甲导入农杆菌得到的重组农杆菌甲和将重组质粒乙导入农杆菌得到的重组农杆菌乙组成。本发明专利技术还提供了一种制备模型植物的方法，包括如下步骤：将所述重组农杆菌组合侵染受体植物的植株叶片，得到模型植物。所述模型植物为具有如下表型的植物：叶片卷曲和/或叶片皱缩和/或叶片黄化。所述模型植物可用于进行药物筛选和机理研究。用于进行药物筛选和机理研究。

【技术实现步骤摘要】
ID NO：1或SEQ ID NO：3所示；DNA分子乙如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示。
[0013]本专利技术还提供了用于制备模型植物的产品，包括以上任一所述重组质粒组合和农杆菌。
[0014]具体的，所述农杆菌为农杆菌EHA105。
[0015]本专利技术还提供了用于制备模型植物的产品，包括以上任一所述重组农杆菌组合。
[0016]所述产品还可包括植物或植物种子。
[0017]本专利技术还提供了以上任一所述重组质粒组合或者以上任一所述重组农杆菌组合或以上任一所述DNA分子组合在制备产品中的应用；所述产品的功能为制备模型植物。
[0018]本专利技术还提供了以上任一所述重组质粒组合或者以上任一所述重组农杆菌组合或以上任一所述DNA分子组合在制备模型植物中的应用。
[0019]本专利技术还提供了一种制备模型植物的方法，包括如下步骤：将以上任一所述重组农杆菌组合侵染受体植物的植株叶片，得到模型植物。
[0020]所述方法具体包括如下步骤：
[0021](1)用农杆菌悬浮缓冲液悬浮重组农杆菌甲的菌体，使体系OD
600nm
值为1.0；
[0022](2)用农杆菌悬浮缓冲液悬浮重组农杆菌乙的菌体，使体系OD
600nm
值为1.0；
[0023](3)将步骤(1)得到的菌液和步骤(2)得到的菌液等体积混合，然后室温避光静置3h，即为侵染液。
[0024](4)将步骤(3)得到的侵染液注射至受体植物的植株叶片中，然后培养5
‑
20天。
[0025]所述步骤(4)具体可为：将步骤(3)得到的侵染液注射至受体植物的植株叶片中，每个叶片注射500μL，然后培养5
‑
20天。
[0026]除了太小不能完成注射的叶片，植株的所有叶片均进行注射。
[0027]具体的，所述受体植物的植株为4
‑
5叶期的植株。
[0028]具体的，所述培养的条件为：25℃、14小时光照/10小时黑暗。
[0029]以上任一所述模型植物为具有如下表型的植物：叶片卷曲和/或叶片皱缩和/或叶片黄化。
[0030]以上任一所述植物为茄科植物。
[0031]以上任一所述植物为烟草属植物。
[0032]以上任一所述植物为本生烟或心叶烟。
[0033]以上任一所述产品可为试剂盒。
[0034]本专利技术首先从具有发病表型的植物组织中发现了两个DNA分子，分别命名为DNA分子甲和DNA分子乙。专利技术人将两个正向重复的DNA分子甲构建到双元表达载体pCAMBIA1300上，得到了重组质粒甲。专利技术人将两个正向重复的DNA分子乙构建到双元表达载体pCAMBIA1300上，得到了重组质粒乙。进一步，专利技术人将重组质粒甲和重组质粒乙导入农杆菌菌株EHA105，获得了病毒侵染性克隆，该病毒侵染性克隆能够成功侵染烟草植株，并使植株呈现叶片卷曲和/或叶片皱缩和/或叶片黄化的表型，从而可作为模型植物。所述模型植物可用于进行药物筛选和机理研究。本专利技术为研究该病毒基因组结构、病毒蛋白的功能、以及病毒与宿主之间的互作提供了实验材料，对于探寻防控该病毒方法具有重要的指导意义。
附图说明
[0035]图1为重组质粒的构建示意图。
[0036]图2为本生烟的表型照片。
[0037]图3为本生烟的PCR鉴定结果。
[0038]图4为心叶烟的表型照片。
[0039]图5为心叶烟的PCR鉴定结果。
具体实施方式
[0040]下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。以下提供的实施例可作为本
普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本专利技术的限制。
[0041]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中的引物均为单链DNA分子，均为5
’→3’
方向。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。农杆菌悬浮缓冲液：含10mM MgCl2、10mM MES(pH5.6)、150mM乙酰丁香酮，余量为ddH2O。
[0042]实施例1、两个DNA分子的获得
[0043]1、在田间采集具有发病表型(叶片黄化、卷曲和皱缩)的雪茄烟植株叶片(简称病叶)。
[0044]2、总DNA的提取
[0045]采用CTAB法提取病叶的总DNA，具体操作如下：称取0.1g新鲜叶片放入2mL离心管中，液氮速冻后在磨样仪中(频率设定为50Hz)研磨1分钟至粉末；加入500μL65℃预热的CTAB抽提液(使用时加入2％v/v的β
‑
巯基乙醇)，65℃加热30min；加入等体积的氯仿
‑
异戊醇(体积比为24：1)，上下混匀抽提，12000rpm离心10min；将上清小心转入新的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇室温沉淀10min，12000rpm离心10min，弃掉上清；用1mL 70％酒精洗涤沉淀，12000rpm离心5min，用1mL的无水乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min，弃掉上清；干燥后加入50μL ddH2O溶解，加入1μL RNAase(10μg/μL)混匀，37℃消化30min，
‑
20℃保存。
[0046]3、序列的获得
[0047]取约500ng步骤2获得的总DNA，通过引物扩增以及测序以及预试验功能验证，发现了两个具有生物学活性的DNA分子，分别命名为DNA分子甲和DNA分子乙。经序列分析，DNA分子甲和DNA分子乙属于黄花稔曲叶病毒。
[0048]DNA分子甲如SEQ ID NO：1所示(2760bp)。
[0049]DNA分子乙如SEQ ID NO：2所示(1369bp)。
[0050]实施例2、两个重组质粒的构建
[0051]重组质粒的构建示意图见图1。
[0052]一、重组质粒甲的构建
[0053]1、合成SEQ ID NO：1所示的双链DNA分子。
[0054]2、以步骤1得到的DNA分子为模板，采用上游引物F1
‑
1和下游引物R1
‑
1组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
[0055]F1
‑
1：gagctcggtacccggGGATCCgaattcttttcctcgtccagg；
[0056]R1
‑
1：CCTGGACGAGGAAAAGAATTCcgctttaaagacttgggcttt。
[0057]PCR扩增的反应体系(50μL)：模板DNA 3μL、上游引物(10μM)1μL、下游引物(10μM)1μL、10μ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组质粒组合，由两个重组质粒组成；所述两个重组质粒分别命名为重组质粒甲和重组质粒乙；所述重组质粒甲中具有SEQ ID NO：3所示的DNA分子；所述重组质粒乙中具有SEQ ID NO：4所示的DNA分子。2.如权利要求1所述的重组质粒组合，其特征在于：所述重组质粒甲为：将pCAMBIA1300载体中BamH I和Pst I酶切识别序列之间的小片段取代为SEQ ID NO：3所示双链DNA分子，得到的重组质粒；所述重组质粒乙为：将pCAMBIA1300载体中BamH I和Pst I酶切识别序列之间的小片段取代为SEQ ID NO：4所示双链DNA分子，得到的重组质粒。3.重组农杆菌组合，由两个重组农杆菌组成；所述两个重组农杆菌分别命名为重组农杆菌甲和重组农杆菌乙；所述重组农杆菌甲是将权利要求1或2中所述的重组质粒甲导入农杆菌得到的；所述重组农杆菌乙是将权利要求1或2中所述的重组质粒乙导入农杆菌得到的。4.如权利要求3所述的重组农杆菌组合，其特征在于：所述农杆菌为农杆菌EHA105。5.DNA分子组合，由DNA分子甲和DNA分子乙组成；DNA分子甲如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶健，张璇，王端，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：