番茄SlZF14基因在提高植物低温抗性中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种番茄SlZF14基因在提高植物耐低温能力中的应用，通过基因过表达技术使所述番茄SlZF14基因的表达水平上升，所述基因为SEQ ID NO：1所示的苷酸序列。结果发现，低温下SlZF14过表达可以诱导番茄低温抗性基因的表达，提高番茄的低温抗性。而在SlZF14基因编辑植株中，番茄的低温抗性明显受到了抑制。本发明专利技术为培育耐低温番茄新品种提供了基因资源，具有较好的潜在应用价值，为研究番茄植物应答逆境信号的机制和耐受不利环境的分子机理奠定理论基础。理奠定理论基础。理奠定理论基础。

【技术实现步骤摘要】
番茄SlZF14基因在提高植物低温抗性中的应用


[0001]本申请涉及基因工程、分子生物学及生理学等领域，具体地说，尤其涉及番茄SlZF14基因在提高植物低温抗性中的应用。

技术介绍

[0002]番茄(Solanumlycopersicum L.)属于茄科作物，番茄属的一年生或多年生草本植物。低温引起的作物减产是世界范围内普遍存在的问题。番茄作为一种栽培广泛的喜温蔬菜，低温对其生长发育会产生极为严重的影响。提高番茄抵御低温的能力、培育耐低温品种具有重要的实际生产意义。
[0003]植物在感受低温胁迫信号后，转录因子对胁迫相关基因的表达调控起着至关重要的作用。C2H2型锌指蛋白是真核生物中研究最为清楚的一类转录因子，含有植物特有的QALGGH保守序列，可以调控植物体内多种生理生化反应，通过识别靶标DNA或与RNA的相互作用，在植物的生长发育和抗逆胁迫中发挥重要的作用。目前番茄C2H2型锌指蛋白在低温胁迫中的作用的研究还鲜见报道。有研究利用转基因手段将番茄C2H2型锌指蛋白基因SlZFP1在拟南芥和水稻中过表达，发现能够诱导下游一系列低温响应基因的表达，增强拟南芥和水稻的抗冷性。但通过直接构建番茄C2H2型锌指蛋白基因的转基因材料来改变番茄植株的低温抗性的方法尚未实现。
[0004]因此，通过对SlZF14基因的克隆、转基因技术培育不同表达量SlZF14的番茄材料，在提高番茄对低温胁迫的抗性以及挖掘逆境胁迫基因资源方面，具有良好的应用前景。

技术实现思路

[0005]鉴于此，本申请实施例提供一种番茄SlZF14基因在提高植物低温抗性中的应用。
[0006]根据本申请实施例，提供番茄SlZF14基因在控制番茄低温抗性中的应用，通过基因过表达技术使所述番茄SlZF14基因的表达水平上升，所述基因为SEQ ID NO：1所示的苷酸序列。
[0007]可选的，所述基因过表达技术具体如下：
[0008]提取番茄总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，F和R为引物，扩增SlZF14基因，将扩增产物构建到过表达载体上；所述引物F和R的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；将过表达载体导入宿主细胞中，再利用其侵染目的植株，筛选并获得阳性转基因植株。
[0009]可选的，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。
[0010]可选的，所述农杆菌细胞为GV3101。
[0011]可选的，所述过表达载体为具有35S启动子的表达载体。
[0012]可选的，过表达载体质粒为pFGC1008::SlZF14
‑
HA。
[0013]本申请的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：
[0014]本专利技术通过基因过表达技术使所述番茄SlZF14基因的表达水平上升，通过低温处
理，发现SlZF14在番茄耐低温胁迫中起到正向调控的作用。
[0015]应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本申请。
附图说明
[0016]此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。
[0017]图1为本专利技术实施例1中SlZF14基因过表达番茄株系的植物蛋白Western Blot检测结果。
[0018]图2为本专利技术实施例2中SlZF14基因敲除番茄株系的sgRNA序列的测序结果。
[0019]图3为本专利技术实施例4中在常温与低温条件下，转基因番茄SlZF14
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OE#1和SlZF14
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OE#3、zf14#2、zf14#6表现耐低温的表型。
[0020]图4为本专利技术实施例4中在常温与低温条件下，转基因番茄SlZF14
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OE#1和SlZF14
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OE#3、zf14#2、zf14#6的电导率变化。
[0021]图5为本专利技术实施例4中在常温与低温条件下，转基因番茄SlZF14
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OE#1和SlZF14
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OE#3、zf14#2、zf14#6的PSII最大光化学量子产量(Fv/Fm)变化。
具体实施方式
[0022]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术并不限于以下实施例。
[0023]实施例1：SlZF14过表达载体的构建
[0024]从番茄基因组中克隆了SlZF14基因。根据编码区序列分析，设计特异性引物SlZF14
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F和SlZF14
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R，并在引物上分别加上限制性酶切位点(Asc I和Kpn I)，序列如SEQ ID NO:3和4所示。用KOD高保真酶PCR扩增SlZF14片段，然后对载体进行酶切，将SlZF14片段同源重组到pFGC1008
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HA上，得到过表达载体pFGC1008::SlZF14
‑
HA。将上述重组质粒送到尚亚公司测序确认，所得的基因SlZF14的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。结果表明所克隆的序列与Solgenomics中公布的序列(Solyc06g075780)一致。
[0025]实施例2：SlZF14基因突变载体的构建
[0026]SlZF14基因靶序列通过CRISPR
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P网站设计，具体序列如SEQ ID NO:5所示，合成的靶序列退火后连接到AtU6
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sgRNA
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AtUBQ
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Cas9载体的Bbs I位点，然后将新得到的AtU6
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sgRNA
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AtUBQ
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Cas9片段连接到pCAMBIA1301载体的Hind III/Kpn I位点，构建出番茄SlZF14基因CRISPR表达载体。将上述重组质粒送到尚亚公司测序确认。
[0027]实施例3：番茄SlZF14转基因材料的构建与检测
[0028]将过表达载体pFGC1008::SlZF14
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HA和基因编辑载体pCAMBIA1301::AtU6
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sgRNA(SlZF14)
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AtUBQ
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Cas9。转化农杆菌GV3101，并进行番茄子叶侵染，通过诱导愈伤，抗性诱导分化以及生根培养，获得组培苗，将T1代突变体种子和过表达种子分别进行卡那霉素抗性和氯霉素抗性的测试，选择3/4具有抗性而其余1/4没有抗性的株系，说明在该株系中连有目的基因的过表达载体以单拷贝形式插入。将这些植株移除，再进行单株收种。利用Western Blot验证SlZF14过表达阳性转基因植株，结果显示野生型没有蛋白条带，而过表
达株系有SlZF14
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HA的条带(图1)。利用PCR和测序技术验证阳性S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.番茄SlZF14基因在控制番茄低温抗性中的应用，通过基因过表达技术使所述番茄SlZF14基因的表达水平上升，所述基因为SEQ ID NO：1所示的苷酸序列。2.由权利要求1所述，其特征在于，所述基因过表达技术具体如下：提取番茄总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，F和R为引物，扩增SlZF14基因，将扩增产物构建到过表达载体上；所述引物F和R的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；将过表达载体导入...

【专利技术属性】
技术研发人员：周艳虹，王羚羽，邹瑜文，夏晓剑，喻景权，
申请(专利权)人：安庆市长三角未来产业研究院，
类型：发明
国别省市：