一种以葡萄种子为受体材料的农杆菌介导遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种以葡萄种子为受体材料的农杆菌介导遗传转化方法，属于植物基因工程技术领域。该方法包括以下步骤：S1、葡萄种子经预处理后，培养至种皮开裂；S2、采用农杆菌侵染法将种皮开裂的葡萄种子侵染，得到侵染后的葡萄种子；S3、侵染后的葡萄种子培养后，筛选得到农杆菌转化植株。本发明专利技术方法中再生植株的发生途径绕开了由外植体脱分化形成、愈伤组织再分化形成体胚的漫长步骤，且受体统一、充足，只需4个月就可生长为完整葡萄小苗，相较于胚性愈伤受体材料的转化周期缩短了2个月，为建立高效葡萄遗传转化体系奠定了强有力的技术支撑。效葡萄遗传转化体系奠定了强有力的技术支撑。效葡萄遗传转化体系奠定了强有力的技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种以葡萄种子为受体材料的农杆菌介导遗传转化方法


[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，特别是涉及一种以葡萄种子为受体材料的农杆菌介导遗传转化方法。

技术介绍

[0002]葡萄(Vitis L.)是世界上种植最广泛、最具经济价值的水果作物之一。葡萄以其外形美观、味道鲜美、营养价值高、众多保健功能而深受消费者喜爱，被誉为“水果皇后”。例如，葡萄浆果富含多种生物活性物质，如多酚类、黄酮类、花青素、植物纤维以及多种维生素和矿物质，可以保护皮肤和心血管及神经系统，并提供抗菌、抗氧化作用与抗炎症作用。然而，由于广泛栽培的葡萄属植物多为欧亚种，其抗抗逆性普遍较差；同时作为多年生果树类作物童期长、基因组高度杂合，新品种的培育受到季节、地域等众多因素的限制，致使传统育种方式年限较长、选择过程繁琐费时。作为一种替代方法，遗传转化可以通过在不改变理想性状的情况下添加单一性状来改变葡萄品种的特性。一个快速、高效、可重复的遗传转化系统是实现葡萄品种改良的前提条件。
[0003]葡萄属植物高频的再生体系的建立是开展遗传转化的基础。尽管目前通过器官发生途径如欧洲葡萄叶片、茎节和花药为受体获取了葡萄体外再生植株，但仍然缺乏能够实现葡萄属植物高效遗传转化系统。因此，与花器、茎段、叶片和其他外植体材料相比，未成熟的合子胚可以被长期保存，且不易受季节性因素和处理技术的影响。目前，通过未成熟合子胚途径建立再生系统已在水稻、小麦、玉米等谷类作物中广泛实现，而在葡萄属植物中以种子作为受体材料进行农杆菌介导的遗传转化的报道较少。迄今为止，分子育种遗传转化工具不仅促进了非生物胁迫抗性品种的创制，而且为改善植物的品质、营养等农艺性状提供了技术支持。遗传转化可在不改变品种特性的情况下，借助DNA转移技术对植物进行遗传改良以提高其农艺性状的可能性，如将抗病或抗除草剂基因转移到现有的无性系作物上，且能够极大缩短育种周期。因此，通过打破葡萄种子休眠诱导初生胚萌发为建立高效遗传转化奠定了强有力的技术支撑。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种以葡萄种子为受体材料的农杆菌介导遗传转化方法，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术通过农杆菌介导，以葡萄种子作为受体材料进行侵染，绕开了由外植体脱分化形成、愈伤组织再分化形成体胚的漫长步骤，相较于胚性愈伤组织为受体的遗传体系，转化周期缩短了2个月。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0006]本专利技术提供一种以葡萄种子为受体材料的农杆菌介导遗传转化方法，包括以下步骤：
[0007]S1、葡萄种子经预处理后，培养至种皮开裂；
[0008]S2、采用农杆菌侵染法将种皮开裂的葡萄种子侵染，得到侵染后的葡萄种子；
[0009]S3、侵染后的葡萄种子培养后，筛选得到农杆菌转化植株。
[0010]进一步的，在步骤S1中，所述预处理包括：将葡萄种子置于赤霉素溶液浸泡后，再进行水浴处理；所述水浴处理的温度为55℃。
[0011]其中，种子最佳预处理方式，是将破除种子休眠方式高效应用于遗传转化体系中，又能使得农杆菌充分渗入种子内部，因此借助种子自身萌发力将种子预培养至种壳开裂≥1mm时为最佳侵染状态。
[0012]进一步的，所述预处理还包括消毒处理以及皮切处理。
[0013]进一步的，在步骤S2中，所述农杆菌侵染法的步骤包括：将农杆菌活化后培养，得到农杆菌侵染液，将步骤S1中得到的种皮开裂的葡萄种子放入容器中，随即倒入所述农杆菌侵染液封口，然后抽真空侵染。
[0014]进一步的，所述农杆菌侵染液的OD值为0.6。
[0015]进一步的，所述农杆菌活化过程中，在农杆菌菌液中添加200mM的乙酰丁香酮。
[0016]进一步的，所述抽真空侵染的时间为3min。
[0017]进一步的，在步骤S3中，所述培养的步骤包括：将侵染后的葡萄种子培养至初生子叶萌发并于暗光下转色。
[0018]进一步的，所述培养采用的培养基的组分包括250mg
·
L
‑1头孢霉素和250mg
·
L
‑1羧苄青霉素。
[0019]进一步的，在步骤S3中，所述筛选包括采用培养基进行筛选培养，所述筛选采用的培养基组分包括250mg
·
L
‑1头孢霉素、250mg
·
L
‑1羧苄青霉素和30mg
·
L
‑1卡那霉素。
[0020]对于卡那霉素浓度筛选，是将种子首选在MEL3预培养基培养至其初生子叶完全萌发并转色后，依次接种至含有0、10、20、30、40和50mg
·
L
‑1Kan的生根培养基中，8/16h(光照/黑暗)条件，培养8周左右统计存活率及其生根情况。
[0021]本专利技术公开了以下技术效果：
[0022]本专利技术以葡萄种子为外植体，取材方便、不受季节限制也可长期保存。重要的是只需20d就可萌发形成完整初生胚，将初生胚置于生根培养基中生长至形成健全葡萄植株仅需40d，因此再生时间上占有较大优势。种子再生萌发整齐为农杆菌侵染提供了充分的受体材料，且葡萄种壳开裂时间相近为农杆菌菌液快速进入且充分侵染带来极大便利。因此，基于再生效率之上其转化效率高达12.8％。本专利技术方法中再生芽的发生途径绕开了由外植体脱分化形成、愈伤组织再分化形成体胚的漫长步骤，且受体统一、充足，只需4个月就可形成完整葡萄小苗，相较于胚性愈伤遗传转化周期缩短了2个月。
附图说明
[0023]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0024]图1为pHZM03::EGFP表达载体的T
‑
DNA示意图；
[0025]图2为
‘
霞多丽
’
叶片GFP荧光检测图，其中，A为不同处理方式的叶片；B为转化叶片和野生型叶片；
[0026]图3为遗传转化过程示意图；其中a.种子预培养至种皮开裂≥1mm，b.超声处理，c.抽真空处理，d.针刺造伤处理，e.常规处理，f.
‘
霞多丽
’
初生子叶胚，g.生根筛选培养基，h.筛选80d后的植株，i.再生植株，j.移栽至V
基质
：V
蛭石
：V
珍珠岩
＝3:1:1，k.获取
‘
霞多丽
’
转基因植株；
[0027]图4为pHZM03::EGFP载体转化后Western Blot检测图；1
‑
13为转基因植株，WT为未转化植株对照；
[0028]图5为pHZM03::VaMYB4a::EGFP表达载体的T
‑
DNA示意图；
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以葡萄种子为受体材料的农杆菌介导遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、葡萄种子经预处理后，培养至种皮开裂；S2、采用农杆菌侵染法侵染种皮开裂的葡萄种子，得到侵染后的葡萄种子；S3、培养所述侵染后的葡萄种子，筛选得到农杆菌转化植株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S1中，所述预处理包括：将葡萄种子置于赤霉素溶液浸泡后，再进行水浴处理；所述水浴处理的温度为55℃。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述预处理还包括消毒处理以及皮切处理。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述农杆菌侵染法的步骤包括：将农杆菌活化后培养，得到农杆菌侵染液，将步骤S1中得到的种皮开裂的葡萄种子浸没于所述农杆菌侵染液，然后真空侵染。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述农杆菌侵染液的OD值为0.6。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐伟荣，张俊霞，郝新意，张宁波，
申请(专利权)人：宁夏大学，
类型：发明
国别省市：