一种利用脂质转运蛋白基因启动子调控目的基因表达的方法、转化载体及其应用技术

本发明专利技术涉及一种利用脂质转运蛋白基因启动子调控目的基因在植物分泌型腺毛中表达的方法、在该方法中应用的载体和其在植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用。所述启动子为AaLTP1基因的启动子，能够调控目的基因在植物分泌型腺毛中特异表达。同时本发明专利技术还涉及前述基因启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的用途。由于利用植物腺毛特异表达的启动子对植物的腺毛系统进行遗传操作时，不会对植物的生长发育造成危害。因此，本发明专利技术对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。重要意义。重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种利用脂质转运蛋白基因启动子调控目的基因表达的方法、转化载体及其应用


[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，尤其涉及一种利用脂质转运蛋白基因启动子调控目的基因表达的方法、转化载体及其应用。

技术介绍

[0002]青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属一年生草本植物，植株有浓烈的挥发性香气，其植株中含有许多次级代谢产物：青蒿素、挥发油、α
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蒎烯、樟脑、青蒿酮等，此外还含有很多黄酮类化合物。青蒿素(Artemisinin)是从其地上部分分离出的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，作为世界卫生组织(WHO)推荐的抗疟疾药物联合治疗(Artemisinin
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based combination therapies，ACTs)的主要有效成分。目前青蒿素的主要来源是从青蒿的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低(0.01％
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1％)，这使得这种药物的大规模商业化生产受到了极大限制。
[0003]青蒿的叶片表面有两种表皮毛：分泌型腺毛(glandular secretory trichomes，GSTs)和非分泌型表皮毛(T
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shape trichomes，TSTs)，两种表皮毛对于植物的生长、发育、防御、花粉传播等都起到至关重要的作用。启动子是位于基因5'端上游的特定核苷酸序列，就像一个“开关”，通过顺式作用元件和反式作用因子的相互作用来发挥其特定的功能。启动子一共分三种：组成型启动子、特异型启动子、诱导型启动子。在目前青蒿的基因工程研究中，多采用组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)，这种启动子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达，而不能在特异组织和器官中调控目的基因的表达，会过度消耗细胞内的物质和能量，极可能对植物造成一定的负担和危害，影响植物的正常生长。因此急需找到在植物的组织器官中特异性表达的启动子来代替组成型启动子，更好地对植物基因进行调控。由于以腺毛特异表达的启动子对于植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，可以克服组成型启动子的种种弊端。植物脂质转运蛋白基因LTPs具有多种生理功能，包括植物信号传导，角质和蜡代谢合成，细胞壁延伸，花粉发育，体细胞胚胎发生，种子发芽、生物胁迫和非生物胁迫。因此，克隆到植物腺毛组织特异表达的AaLTP1基因启动子对于青蒿素代谢工程具有十分重要的意义。
[0004]因此，本领域的技术人员致力于开发一种不会对植物生长造成危害的的启动子。

技术实现思路

[0005]为了克服现有植物基因工程技术的不足，同时为深入研究分泌型腺毛的起始和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控。本专利技术提供一种在植物分泌型腺毛中特异表达的启动子，能引导基因在转基因植物的分泌型腺毛中特异表达，并不会对植物的生长发育造成危害。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了一种利用脂质转运蛋白基因启动子调控目的基因在植物分泌型腺毛中表达的方法，其特征在于，所述脂质转运蛋白基因为植物腺毛组织特
异表达的AaLTP1基因，所述基因的启动子为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
[0007]在本专利技术的较佳实施方式中，方法包括以下步骤：
[0008]步骤一，培养青蒿无菌苗；
[0009]步骤二，利用步骤一中培养的青蒿无菌苗通过PCR克隆获取AaLTP1启动子；
[0010]步骤三，分析AaLTP1启动子上面的顺式作用元件，确定AaLTP1基因启动子类型；
[0011]步骤四，将步骤二中克隆到的启动子连接连入pCAMBIA1391z载体，并融合报告基因，构建转化载体；
[0012]步骤五，将步骤四中构建好的转化载体转化根癌农杆菌并检测；
[0013]步骤六，将步骤五中获得的带有转化载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿；
[0014]步骤七，PCR检测步骤六中获得的转基因青蒿植株；
[0015]步骤八，启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位的确定。
[0016]在本专利技术的另一较佳实施方式中，所述步骤二具体包括：
[0017]从步骤一中获得的青蒿无菌苗叶片中提取基因组DNA，并以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR法进行扩增，其中两轮巢式PCR中采用的引物序列包括：
[0018]PF1：ACGTTAGCTCTTTTGCTAAGGACCAT
[0019]PR1：TACTGGTTAGGTAGGTCACACACG
[0020]PF2：CTTACACGTTCTTACTTTAATTTTATA
[0021]PR2：ACCATTTCTCCACTTGCTATTACT。
[0022]在本专利技术的另一较佳实施方式中，所述步骤四中，所述转化载体为pCAMBIA1391z
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proLTP1载体，为构建转化载体，向正向引物中引入BamH I酶切位点，反向引物中引入Nco I酶切位点。
[0023]在本专利技术的另一较佳实施方式中，所述步骤四中，引物序列如下所示：
[0024]1391z
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proLTP1
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F：
[0025]CAGGTCGACGGATCCCTTACACGTTCTTACTTTAATTTTATA；
[0026]1391z
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proLTP1
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R：
[0027]TCAGATCTACCATGGTTCTCCACTTGCTATTACTTTAATT。在本专利技术的另一较佳实施方式中，所述步骤五中采用的根癌农杆菌为EHA105。
[0028]在本专利技术的另一较佳实施方式中，所述步骤六具体包括：使用青蒿种子进行外植体的预培养，获得无菌苗叶片外植体，将所述叶片的外植体与带有转化载体的根癌农杆菌共培养，将共培养获得的青蒿外植体转入发芽筛选培养基上，经过2
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3次继带培养后进行筛选培养获得筛选后的青蒿植株。
[0029]在本专利技术的另一较佳实施方式中，所述步骤七具体包括：
[0030]根据目的基因所在表达盒启动子和GUS基因分别设计正向引物proLTP1:CTTACACGTTCTTACTTTAATTTTATA和反向引物GUSR：
[0031]ATCCAGACTGAATGCCCACA对GUS基因进行检测。
[0032]一种上述利用脂质转运蛋白基因启动子调控目的基因在植物分泌型腺毛中表达的方法中使用的载体，所述载体为pCAMBIA1391z
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proLTP1载体，含有植物腺毛组织特异表达的AaLTP1基因的启动子以及GUS报告基因。
[0033]一种上述利用脂质转运蛋白基因启动子调控目的基因在植物分泌型腺毛中表达
的方法在植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用。
[0034]技术效果
[0035]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术利用有效的青蒿本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用脂质转运蛋白基因启动子调控目的基因表达的方法，其特征在于，所述脂质转运蛋白基因为植物腺毛组织特异表达的AaLTP1基因，所述基因的启动子为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的一种利用脂质转运蛋白基因启动子调控目的基因表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，培养青蒿无菌苗；步骤二，利用步骤一中培养的青蒿无菌苗通过PCR克隆获取AaLTP1启动子；步骤三，分析AaLTP1启动子上面的顺式作用元件，确定AaLTP1基因启动子类型；步骤四，将步骤二中克隆到的启动子连接连入pCAMBIA1391z载体，并融合报告基因，构建转化载体；步骤五，将步骤四中构建好的转化载体转化根癌农杆菌并检测；步骤六，将步骤五中获得的带有转化载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿；步骤七，PCR检测步骤六中获得的转基因青蒿植株；步骤八，启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位的确定。3.如权利要求2所述的一种利用脂质转运蛋白基因启动子调控目的基因表达的方法，其特征在于，所述步骤二具体包括：从步骤一中获得的青蒿无菌苗叶片中提取基因组DNA，并以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR法进行扩增，其中两轮巢式PCR中采用的引物序列包括：PF1：ACGTTAGCTCTTTTGCTAAGGACCATPR1：TACTGGTTAGGTAGGTCACACACGPF2：CTTACACGTTCTTACTTTAATTTTATAPR2：ACCATTTCTCCACTTGCTATTACT。4.如权利要求2所述一种利用脂质转运蛋白基因启动子调控目的基因表达的方法，其特征在于，所述步骤四中，所述转化载体为pCAMBIA1391z
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proLTP1载体，为构建转化载体，向正向引物中引入BamH I酶切位点，反向引物中引入Nco I酶切位点。5.如权利要求4所述一种利用脂质转运蛋白基因启动子调控目的基因表达的方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎凌，贺威智，王伟，刘航，唐克轩，付雪晴，孙小芬，赵静雅，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：