一种利用生物技术创制发光麻竹的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用生物技术创制发光麻竹的方法。将真菌生物发光通路中5个关键基因HispS、Luz、H3H、CPH和NPGA克隆到麻竹表达载体上，然后通过农杆菌介导的瞬时转染方法侵染毛竹幼苗，并通过全自动化学发光成像分析系统检测到了自发光信号。为了进一步获得可稳定遗传的自发光麻竹，我们通过对麻竹嫩芽的体外诱导成功获得麻竹愈伤组织，并利用农杆菌侵染麻竹愈伤组织，对麻竹愈伤组织进行遗传转化，最后获得了可以自发光的麻竹愈伤组织。本发明专利技术在原有载体FBP

【技术实现步骤摘要】
一种利用生物技术创制发光麻竹的方法


[0001]本专利技术涉及生物方法专利
，具体地说，是一种利用生物技术创制发光麻竹的方法。

技术介绍

[0002]生物发光是生物通过化学反应而产生光的现象，它存在于许多不同的生物中，包括细菌、真菌、昆虫以及海洋生物。随着生物发光机制被完整地阐明，科学家们开始利用基因工程手段创造自发光植物。近年，科学家通过在其他植物中重建真菌生物发光通路获得了无需额外添加外源底物便能在黑暗中肉眼可见的自发光烟草、大丽花和拟南芥等。
[0003]2018年，发光蘑菇(Neonothopanusnambi)的真菌生物发光通路(fungal bioluminescencepathway，FBP)的阐明为自发光植物的创造提供了新的策略。2020年3月，Khakhar等人基于FBP，构建了植物表达载体FBP
‑
12，利用转基因技术得到了自发光烟草(NicotianatabacumL.)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、番茄(Lycopersiconesculentum)、大丽花(DahliapinnataCav.)及玫瑰花(Rosassp.)。同年4月，《自然
·
生物技术》在线发表了俄罗斯科学家们的一项研究，该研究中，科学家们在烟草中重建FBP，获得了在黑暗中肉眼可见的且可遗传编码的自发光烟草，烟草花朵处的发光强度高达1010个光子/min；同时，科学家们还比较了温室中15株不同转基因自发光烟草株系与野生型烟草的差异，发现除了转基因植株株高中位数增加了12％以外，其他如整体表型、叶绿素与胡萝卜素含量、种子萌发率和开花时间都与野生型植株无差异。这表明在植物中重建FBP并不会对植物生长造成明显的负担。然而，目前这一技术仅在双子叶植物中实现，而对于单子叶植物竹子却暂无报道。
[0004]竹子具有生长速度快、体型高大和生命力顽强等特点，这些生物学特征使得自发光竹子比自发光烟草、拟南芥等体型较小的模式植物更具应用价值。同时竹子因其重大的经济、生态和文化价值而闻名，它除了作为建筑材料和食材外，还因形态优美而作为一种常见的园林、街道景观植物，如果能具有自发光特性，竹子将具有更高的观赏价值和应用价值。
[0005]本专利技术在麻竹中重建真菌生物发光通路，以期创造出更具观赏性的自发光麻竹，通过实现麻竹自发光，我们可以实时监测麻竹的新陈代谢、生长发育、发病机制、对环境因子的响应和对化学物质的反应等生命过程，这不仅有助于推动麻竹基础研究的发展，还为研究生态环境中水、空气、土质等污染的监测提供了工具。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种利用生物技术创制发光麻竹的方法。
[0007]实现本专利技术目的的技术方案是提供一种利用生物技术创制发光麻竹的方法，采用以下引物：
[0008]pUBI
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H3H
‑
Acc65I
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F:ggatccccgggtaccatggcatcctttgaaaattc；
[0009]pUBI
‑
H3H
‑
SpeI
‑
R:gatcgatccactagttgtaattgtaaatagtaatt；
[0010]pUBI
‑
CaMV35S
‑
SpeI
‑
F:agatcaaagggctattgagacttttcaacaaagga；
[0011]pUBI
‑
OCS
‑
SpeI
‑
R:
[0012]atgtttgaacgatcgatccactagtctgctgagcctcgacatgtt；
[0013]pUBI
‑
ACT2
‑
SpeI
‑
F:gtcgaggctcagcagactagtgacaaaatttagaacgaact；
[0014]pUBI
‑
ACT2
‑
R:gtcacacacgattggttgaa；
[0015]pUBI
‑
CPH
‑
FovelapACT2:ccaatcgtgtgtgacatggctcctatctcctccac；
[0016]pUBI
‑
NPGANOS
‑
SpeI
‑
R:ttgaacgatcgatccctatcctgaggacaggcaat；
[0017]具体包括以下步骤：
[0018]S1.麻竹表达载体的设计以及构建：
[0019]首先利用所述的引物，以原有载体FBP
‑
12和pCambia3301为模板，利用PCR技术扩增得到各个目的基因片段，对于需要进行重叠PCR的两个片段，以两个片段为模板，利用片段1的F和片段2的R进行重叠PCR；此时，将Actin 2 promoter跟CPH
‑
SlH4 Terminator
‑
CaMV 35S promoter
‑
NPGA
‑
NOS terminator融合在一起，利用天根通用型DNA产物回收试剂盒回收PCR产物，得到H3H
‑
MAS terminator、CaMV 35S promoter
‑
HispS
‑
CaMV poly(A)signal
‑
CaMV 35S promoter
‑
Luz
‑
OCS terminator和Actin 2 promoter
‑
CPH
‑
SlH4 Terminator
‑
CaMV 35S promoter
‑
NPGA
‑
NOS terminator三个片段，利用NEB限制性核酸内切酶Acc65I和SpeI酶切得到线性化的pUBI载体，利用全式金无缝克隆试剂盒(
‑
Basic Seamless Cloning and Assembly Kit)，将片段H3H
‑
MASterminator克隆到线性化的pUBI载体上，转化全式金TransT1感受态细胞，菌液PCR验证，阳性菌液送测，测序正确的菌株加入终浓度15％的甘油保菌并提质粒得到载体pUBI H3H
‑
MAS terminator，利用NEB限制性核酸内切酶SpeI酶切该载体，得到线性化的pUBI H3H
‑
MAS terminator载体，将片段CaMV 35S promoter
‑
HispS
‑
CaMV poly(A)signal
‑
CaMV 35S promoter
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用生物技术创制发光麻竹的方法，其特征在于，采用以下引物：pUBI
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H3H
‑
Acc65I
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F:ggatccccgggtaccatggcatcctttgaaaattc；pUBI
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H3H
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SpeI
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R:gatcgatccactagttgtaattgtaaatagtaatt；pUBI
‑
CaMV35S
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SpeI
‑
F:agatcaaagggctattgagacttttcaacaaagga；pUBI
‑
OCS
‑
SpeI
‑
R:atgtttgaacgatcgatccactagtctgctgagcctcgacatgtt；pUBI
‑
ACT2
‑
SpeI
‑
F:gtcgaggctcagcagactagtgacaaaatttagaacgaact；pUBI
‑
ACT2
‑
R:gtcacacacgattggttgaa；pUBI
‑
CPH
‑
F ovelap ACT2:ccaatcgtgtgtgacatggctcctatctcctccac；pUBI
‑
NPGA NOS
‑
SpeI
‑
R:ttgaacgatcgatccctatcctgaggacaggcaat；具体包括以下步骤：S1.麻竹表达载体的设计以及构建：首先利用所述的引物，以原有载体FBP
‑
12和pCambia3301为模板，利用PCR技术扩增得到各个目的基因片段，对于需要进行重叠PCR的两个片段，以两个片段为模板，利用片段1的F和片段2的R进行重叠PCR；此时，将Actin 2promoter跟CPH
‑
SlH4 Terminator
‑
CaMV 35S promoter
‑
NPGA
‑
NOS terminator融合在一起，利用天根通用型DNA产物回收试剂盒回收PCR产物，得到H3H
‑
MAS terminator、CaMV 35S promoter
‑
HispS
‑
CaMV poly(A)signal
‑
CaMV 35S promoter
‑
Luz
‑
OCS terminator和Actin 2promoter
‑
CPH
‑
SlH4 Terminator
‑
CaMV 35S promoter
‑
NPGA
‑
NOS terminator三个片段，利用NEB限制性核酸内切酶Acc65I和SpeI酶切得到线性化的pUBI载体，利用全式金无缝克隆试剂盒(
‑
Basic Seamless Cloning and Assembly Kit)，将片段H3H
‑
MAS terminator克隆到线性化的pUBI载体上，转化全式金Trans T1感受态细胞，菌液PCR验证，阳性菌液送测，测序正确的菌株加入终浓度15％的甘油保菌并提质粒得到载体pUBI H3H
‑
MAS terminator，利用NEB限制性核酸内切酶SpeI酶切该载体，得到线性化的pUBI H3H
‑
MAS terminator载体，将片段CaMV 35Spromoter
‑
HispS
‑
CaMV poly(A)signal
‑
CaMV 35S promoter
‑
Luz
‑
OCS terminator克隆到线性化的pUBI H3H
‑
MAS terminator载体上，转化全式金Trans T1感受态细胞，菌液PCR验证，阳性菌液送测，测序正确的菌株加入终浓度15％的甘油保菌并提质粒得到载体pUBI H3H
‑
MAS terminator
‑
CaMV 35S promoter
‑
HispS
‑
CaMV poly(A)signal
‑
CaMV 35Spromoter
‑
Luz
‑
OCS terminator，再次利用NEB限制性核酸内切酶SpeI酶切该载体，得到线性化的pUBI H3H
‑
MAS terminator
‑
CaMV 35Spromoter
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HispS
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CaMV poly(A)signal
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CaMV 35S promoter
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Luz
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OCS terminator载体，将片段Actin 2promoter
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CPH
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SlH4 Terminator
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CaMV 35Spromoter
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NPGA
‑
NOS terminat...

【专利技术属性】
技术研发人员：周军，
申请(专利权)人：常州市祝庄园艺有限公司，
类型：发明
国别省市：