一种烟草NtMAB1基因沉默植株的制备方法及该植株的应用技术

本发明专利技术属于植物生物技术领域，其公开了烟草NtMAB1基因沉默植株的制备方法及该植株的应用，所述烟草NtMAB1基因沉默植株的制备方法包括：对从NtMAB1基因外显子中扩增到序列M1Ri1和序列M1Ri2，分别将两段序列分两次连接到pUCCRNAi载体上，形成两个具有发夹结构的RNAi沉默载体，通过将这两个沉默载体与pCAMBIA1300

【技术实现步骤摘要】
一种烟草NtMAB1基因沉默植株的制备方法及该植株的应用


[0001]本专利技术涉及植物生物
，尤其涉及一种烟草NtMAB1基因沉默植株的制备方法及该植株的应用。

技术介绍

[0002]分枝是植株形态建成的重要构成要素，也是影响作物产量的决定因素之一。烟草是一种以收获叶片为主的经济作物，分枝增多会导致叶片的营养物质减少，进而影响烟叶的产量和质量，因此减少烟草分枝对于烟草生产具有十分重要的意义。在烟草生育期中的现蕾开花期，通常利用打顶措施终止生殖发育过程，以使养分向叶片集中供给；但是打顶后植株顶端优势丧失，烟草腋芽会快速生长成为侧枝，这个过程会消耗大量的营养物质，造成烟叶片营养物质外流并减少，导致烟叶小而薄，油分减少，香气降低，产量和质量严重下降。针对这个问题，目前生产中常规方法是采取人工抹杈或者使用抑芽剂的方法来控制烟草的腋芽生长，但这些方法存在着生产成本升高和环境污染、农药残留等问题。
[0003]在目前分枝发育研究领域中，各种因子的互作以及复杂的激素调控网络使分枝发育机理的解析存在一定困难，但也为分枝发育的调控提供了更多潜在可行的实际运用手段。RAV家族成员在花发育和开花控制方面的功能得到了较深入的解析，但是其参与植物分枝发育过程的分子机制研究甚少。
[0004]因此，鉴定和分离出烟草腋芽发育相关基因，通过基因工程的方法构建烟草腋芽发育相关基因的基因沉默植株，可减少或者避免人工抹杈或使用抑芽剂，为烟叶生产的减工增效、降低农药残留、提升烟叶质量等方面提供新的方法和研究方向。
专利技术内容
[0005]针对目前烟草品种生产中使用人工抹杈或抑芽剂方法控制腋芽，具有高成本、不环保和农残超标等问题，申请人分离并确定了一个新的调控腋芽发育的基因NtMAB1，并通过基因沉默的方法构建了一种烟草NtMAB1基因沉默植株，提供了该植株的具体制备方法及其应用。这种基因沉默植株在打顶后，不需要人工抹杈或使用抑芽剂也能达到控制腋芽生长的效果，为烟叶生产的减工增效、降低农药残留、提升烟叶质量提供新的方法和研究方向。
[0006]本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]本专利技术利用烟草T
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DNA激活标签插入突变体库，在突变群体中发现了一个多分枝、矮化的突变植株，对其命名为mab1(more axillary branches 1)，并对这个突变株系进行分子生物学研究。通过Tail
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PCR、基因型与表型的共分离分析、qRT
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PCR分析确定了候选基因，并对该基因进行基因克隆和蛋白结构分析，确认该基因是RAV家族的一个转录因子，通过NtMAB1基因功能研究，确认NtMAB1基因是烟草腋芽生长发育的一个正调控因子，并对该基因进行具体研究，通过基因工程的方法，构建了一株烟草NtMAB1基因沉默植株。
[0008]上述基因为序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2的核苷酸序列(NtMAB1
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S1和
NtMAB1
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T1)或者其互补序列。其中，本申请的序列NtMAB1
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S1表达的蛋白序列如SEQ ID N0：7。
[0009]第一方面，本专利技术提供上述烟草NtMAB1基因沉默植株的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0010]S1、以具有NtMAB1
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S1基因外显子基因的序列为模板，设计引物通过PCR扩增得到如SEQ ID NO：8所示的M1Ri1片段；对M1Ri1片段和pUCC
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RNAi载体分别进行双酶切、片段纯化后进行连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态，挑取阳性克隆，对阳性克隆进行PCR检测并将扩增产物进行测序，从测序正确的阳性克隆中提取得到pUCC
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Ri1中间载体；
[0011]S2、对pUCC
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Ri1载体进行双酶切和片段纯化，将纯化后pUCC
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Ri1中间载体片段与双酶切纯化后的M1Ri1片段进行连接，得到pUCC
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M1Ri1沉默载体，并对阳性克隆进行PCR鉴定；
[0012]S3、以具有NtMAB1
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S1基因外显子基因的序列(如基因组)为模板，设计引物，通过PCR扩增得到如SEQ ID NO：11所示的M1Ri2片段；其他步骤同S1和S2，构建得到pUCC
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Ri2载体和pUCC
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M1Ri2沉默载体，转化感受态细胞后，对阳性克隆进行PCR鉴定；
[0013]S4、对前述步骤制备得到的pUCC
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M1Ri1、pUCC
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M1Ri2和pCAMBIA1300
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35S载体分别进行单酶切和纯化；将酶切纯化后的pUCC
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M1Ri1和pUCC
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M1Ri2载体片段分别与单酶切后的pCAMBIA1300
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35S载体混合并连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态，于抗性培养基上过夜培养，对阳性克隆进行PCR鉴定；阳性克隆携带的载体为NtMAB1基因的双元沉默载体；
[0014]S5、将前一步构建成功的NtMAB1基因的两个双元沉默载体，pCAMBIA1300
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35S
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M1Ri1和pCAMBIA1300
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35S
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M1Ri2转化农杆菌，通过叶盘法侵染，获得烟草NtMAB1基因沉默植株。
[0015]优选地，S1步骤中，利用如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的M1Ri
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F1和M1Ri
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R1引物对扩增得到M1Ri1片段；S3步骤中，利用SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的M1Ri
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F2和M1Ri
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R2引物对扩增得到M1Ri2片段。
[0016]进一步优选地，上述制备方法具体包括以下步骤：
[0017]S1、利用SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的M1Ri
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F1和M1Ri
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R1引物对，通过PCR扩增得到M1Ri1片段；利用内切酶BamHI和SalI对M1Ri1片段和pUCC
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RNAi载体分别进行双酶切和片段纯化；将纯化后的两个片段等比例混合，连接酶连接后转化大肠杆菌感受态，于Amp抗性LB培养基上过夜培养，通过SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：14的M1Ri
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R1和Rintron
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R1引物对鉴定阳性克隆送测序，得到pUCC
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Ri1中间载体。
[0018]S2、利用内切酶XhoI和BglII对pUCC
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Ri1载体进行双酶切和片段纯化。将纯化后pUCC
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Ri1中间载体片段与BamHI本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烟草NtMAB1基因沉默植株的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：S1、以具有NtMAB1
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S1基因外显子基因的序列为模板，设计引物通过PCR扩增得到如SEQ ID NO：8所示的M1Ri1片段；对M1Ri1片段和pUCC
‑
RNAi载体分别进行双酶切、片段纯化后进行连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态，挑取阳性克隆，对阳性克隆进行PCR检测并将扩增产物进行测序，从测序正确的阳性克隆中提取得到pUCC
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Ri1中间载体；S2、对pUCC
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Ri1载体进行双酶切和片段纯化，将纯化后pUCC
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Ri1中间载体片段与双酶切纯化后的M1Ri1片段进行连接，得到pUCC
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M1Ri1沉默载体，并对阳性克隆进行PCR鉴定；S3、以具有NtMAB1
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S1基因外显子基因的序列为模板，设计引物，通过PCR扩增得到如SEQ ID NO：11所示的M1Ri2片段；其他步骤同S1和S2，构建得到pUCC
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Ri2载体和pUCC
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M1Ri2沉默载体，转化感受态细胞后，对阳性克隆进行PCR鉴定；S4、对前述步骤制备得到的pUCC
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M1Ri1、pUCC
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M1Ri2和pCAMBIA1300
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35S载体分别进行单酶切和纯化；将酶切纯化后的pUCC
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M1Ri1和pUCC
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M1Ri2载体片段分别与单酶切后的pCAMBIA1300
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35S载体混合并连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态，于抗性培养基上过夜培养，对阳性克隆进行PCR鉴定；阳性克隆携带的载体为NtMAB1基因的双元沉默载体；S5、将前一步构建成功的NtMAB1基因的两个双元沉默载体，pCAMBIA1300
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35S
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M1Ri1和pCAMBIA1300
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35S
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M1Ri2转...

【专利技术属性】
技术研发人员：王大伟，夏菲，吴新儒，刘贯山，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所中国烟草总公司青州烟草研究所，
类型：发明
国别省市：