本发明专利技术涉及一种检测结核抗体的试剂盒及其制备方法。本试剂盒由链亲和素包被固相载体，阴、阳性对照，生物素化结核抗原，碱性磷酸酶标记结核抗原，浓缩洗涤液及化学发光底物液组成。本试剂盒采用双抗原夹心反应原理及生物素－亲和素系统包被固相载体，这种方法不仅包被均匀牢固，抗原纯度大大提高，而且可以增加抗原吸附量，节约成本，具有敏感性高、特异性强等特点，能够准确地检测出多种结核病血清中的结核抗体，为临床诊断和结核病普查提供更加可靠的依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫分析医学领域，具体地，本专利技术利用化学发光免疫分析与生物素 -亲和素系统相结合，提供了一种检测结核抗体的化学发光免疫分析试剂盒及其制备 方法。
技术介绍
结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，结核病又称为痨病和"白色瘟疫"， 是一种古老的传染病，可侵入人体全身各种器官。结核病共分为5类原发性肺结核、 血行播散型肺结核、继发性肺结核、结核性胸膜炎及其他肺外结核等，结核病是当今 对人类最具威胁的感染性疾病之一，也是单一传染因子导致死亡的最常见原因，已超 过艾滋病、疟疾、腹泻、热带病死亡人数的总和，严重危害人类健康，成为全球重大 公共卫生问题。据世界卫生组织(WHO)统计，目前全球人口的1/3曾经感染过结核 分枝杆菌，每年出现大约800万新病例，约300万人死于该病。1993年4月23曰， 在伦敦召开的第46届世界卫生大会上，世界卫生组织史无前例地宣布"全球结核病 处于紧急状态"。1998年，再次发出"遏制结核病行动刻不容缓"的呼声。在我国结 核病是国家重点控制的传染病，但结核病的疫情依然相当严重，部分地区有蔓延趋势， 患病人数在世界居第2位，占全球结核病人的1/4，在传染病中居第l位，传染性肺 结核病人约150万，每年约有12.7万人死于结核。降低结核病死亡率的关键是早期 诊断，从而能准确及时的制定合理、科学的治疗方案。 、结核病的初步诊断技术主要有1、痰涂片检查简便易行、准确性高，但阳性 率低；2、痰结核菌培养可信度高，但费时、昂贵且易受用药的影响，应用受到限 制；3、胸部X光准确快速，但易与其他肺部疾病混淆；以上诊断技术普遍存在灵 敏度低、特异性差、耗时长等缺点，因此与对结核病的诊断价值有限。随着分子生物 学技术的迅速发展，用高度敏感的方法检测结核菌及其特异性DNA片段，如PCR、生物探针和基因芯片等，在结核菌检测方面有简便、敏感、特异等优点，但需要相应的 检测设备，技术要求髙，费用高，难以推广。目前ELISA、金标等免疫诊断技术检测 血清中结核抗体，具有简便快速、无需精密仪器、易于推广等特点，但当前所用的诊 断抗原，存在假阳性率高、特异性差等缺点，因此寻找强特异性及免疫原性的诊断抗 原，将几种抗原联合检测能提高灵敏度，不影响特异性，比单一抗原法具有更髙的敏 感性，对结核病的诊断和方法学建立具有十分重要的意义。结核菌抗原38KD是一种分泌蛋白，具有良好的抗原性；ESAT-6抗原是一种分泌 性抗原，在结核菌感染早期产生，并被宿主系统识别，蛋白分子表位众多，且仅在致 病性结核菌中表达，不存在于其他非致病性分支杆菌中，因而是一种具有诊断价值的 特异性抗原；CFP10也是一种分泌性抗原，编码与ESAT-6相邻，均位于结核杆菌的 基因区；因此这3种抗原联合检测结核菌感染，具有灵敏度高、特异性强等优点，对 结核病的血清学诊断具有很高价值。本专利技术则采用38KD、 ESAT-6、 CFP10抗原联合检 测血清中的结核抗体。生物素-亲和素系统(BAS)是近年来发展起来的一种新型生物反应放大系统。生 物素与亲和素间的结合亲和力高、特异性强，具有的多级放大作用。将亲和素(链霉 亲和素)包被固相载体，抗体或抗原与生物素结合，然后通过亲和素一生物素反应而 使生物素化的抗体或抗原固相化，这种方法不仅可增加吸附的的抗体或抗原量，而且 包被均匀、牢固，其结合位点充分暴露，提高了反应的敏感性。本专利技术即采用这种包 被方法，增加了检测的灵敏度。"目前化学发光免疫分析法是一种较先进而有效的方法。其优点是把高灵敏的化学 发光分析方法和特异性强的免疫分析方法相结合，是目前发展和推广应用较快的免疫 分析方法，主要具有灵敏度高、特异性强、试剂价格低廉、试剂稳定且有效期长、方 法稳定快速、检测范围宽、搡作简单自动化程度高等优点。
技术实现思路
本专利技术解决以上诊断技术的不足，将链亲和素包被固相载体，使38KD、 ESAT-6、 CFP10抗原生物素化，与链亲和素结合，加入待测样本后，再加入酶标记的相同抗原， 与载体上包被的抗原和被测样品中的结核抗体形成"双抗原夹心"结构，最后加入 化学发光底物液，通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物， 具有比酶联免疫分析更强的特异性，临床符合率也大大提高，可为结核抗体的诊断 提供更为特异、快速、可靠的依据。本专利技术的目的是提供一种检测结核抗体的试剂盒及其制备方法。 本专利技术的试剂盒包括阴性对照、阳性对照，链亲和素化的固相载体，生物素标 记的抗原，碱性磷酸酶标记的抗原，浓缩洗涤液以及化学发光底物液。其中，所述链 亲和素包被的固相载体为微孔板、塑料珠或塑料管；所述化学发光底物的发光剂为 AMPPD、 CSPD或CDP- Star;优选地，所述化学发光底物液为2. 4%Tris、 16%NaCl、 0.4%KC1、 1. 5°/。HCl、 20。MMPPD和0. l%Proclin300;所述浓缩洗涤液为Tris-HCl缓冲 液。本专利技术的技术方案为1) 将链亲和素包被的固相载体为微孔板、塑料珠或塑料管。2) 链亲和素包被固相载体的制备将适当浓度的链亲和素与0. 05MpH值为7.2 的PBS缓冲液混合，将所得混合液负载于固相载体上；酪蛋白封闭液(含1%酪蛋白、 l°/。Proclin300、 1. 21%Tris和0. 88%NaCl的pH7. 5的Tris缓冲液)封闭；抽湿干燥 后用铝箔袋密封，2-8'C保存。3) 将38KD、 ESAT-6、 CFP10结核抗原混合在一起，用PBS将纯化的抗原稀释； 加入过碘酸钠，4。C反应lOmin;装入透析袋，对PBS透析2次，每次lh，再转入NaHC03 中透析；加入二甲基亚砜溶解的生物素酰肼，室温作用12h;加入硼氣化钾溶液，再 对PBS4'C透析24h，即为生物素化的结核抗原，加等体积甘油，4'C保存备用。4) 用戊二醛法将碱性磷酸酶与结核菌抗原偶联，加入等量甘油，4'C保存。5)将正常人血清过滤除菌后，经含有0.5%BSA的磷酸盐缓冲液稀释后制成阴性 对照；将结核抗体阳性血清过滤除菌后灭活后，经含有0.5y。BSA的磷酸盐缓冲液稀释 后制成阳性对照。6 )配制浓缩洗涤液配制pH值为7. 4的25倍浓缩的Tris-HCl缓冲液，经纯化 水稀释25倍后使用。 -7) 配制化学发光底物液所述化学发光底物液包含2.4OTris、 16%NaCl、 0.4% KC1、 1.5%HC1、 20%AMPPD和0. l%Proclin300。8) 分装上述各组分，组装为成品。本专利技术的试剂盒，通过大量临床实验，选择了最佳的测定方法，既有效地利用了 化学发光技术原理，又充分利用了生物素-亲和素系统，并使用高特异性的38KD、 ESAT-6、 CFP10抗原，确保了检测的灵敏度与特异性，能够准确地检测出多种结核病 血清中的结核抗体，可用于结核病的临床血清学诊断。具体实施例方式实施例1制备本专利技术的结核抗体化学发光免疫分析检测试剂盒本专利技术的结核抗体测定试剂盒包括链亲和素包被的微孔板，阴、阳性对照，生 物素化的结核菌抗原，碱性磷酸酶标记的结核菌抗原，浓缩洗涤液及化学发光底物液； 一、链亲和素包被微孔板的制备(1) 包被将0.05M pH值为7.2的PBS缓冲液与本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测结核抗体的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：链亲和素包被的固相载体，阴、阳性对照，生物素化的抗原，碱性磷酸酶标记的抗原，浓缩洗涤液及化学发光底物液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵娟娟，应希堂，宋胜利，胡国茂，郑金来，张坤，
申请(专利权)人：北京科美东雅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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