嗜铬素A化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法技术

嗜铬素Ａ化学发光定量测定试剂盒，涉及免疫分析医学领域。本发明专利技术提供了嗜铬素Ａ化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法。该试剂盒主要由嗜铬素Ａ抗原校准品；嗜铬素Ａ抗体包被的固相载体；酶标记的嗜铬素Ａ特异性抗体；化学发光底物液；以及浓缩洗涤液组成。本试剂盒采用了双抗体夹心一步法检测人血清中嗜铬素Ａ的含量，能使灵敏度和稳定性得到有效的提高，在临床中有较好的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术主要涉及免疫分析医学领域，提供了一种嗜铬素A化学发光免疫分析 定量测定试剂盒及其制备方法。
技术介绍
嗜铬素A (CgA)又称嗜铬粒蛋白A 、嗜铬蛋白A等，是一种由439个氨基酸 组成的酸性、亲水蛋白质，位于神经内分泌细胞的嗜铬性颗粒内。它是神经肽类 家族中的一员。CgA的蛋白水解作用具有组织特异性，并且这种蛋白质断裂的不同 与它所处的组织有关。肿瘤细胞在免疫组织化学中出现的CgA与神经内分泌原发 性肿瘤有关，神经内分泌肿瘤患者的血清CgA水平增高。血清CgA是现今用于神 经内分泌肿瘤较好的标志物，因此，血清CgA的检验可用于神经内分泌肿瘤的诊 断和治疗。在嗜铬细胞瘤和功能性良性肿瘤方面，CgA比24h尿5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA) 检测具有更高的灵敏性，因此，许多文献和专家都建议把CgA应用于临床一线检 测。CgA的临床意义在于(1) CgA可用于区分嗜铬细胞瘤引起的高血样与非嗜铬细胞瘤引起的原发性或 继发性高血压。(2) CgA是胰岛良性肿瘤和内分泌肿瘤的一个极敏感和精确的标志物，它的水 平和肿瘤的生物学特征、结构特点和疾病范围密切相关。(3) CgA可用于诊断小细胞肺癌，同时应用CgA和NSE联合检测，可提高诊断 的灵敏性。(4) 血清CgA的测定有助于识别促肾上腺皮质激素(ACTH)和促肾皮质激素释 放激素(CRH)异常分泌的肿瘤，例如与神经内分泌相关的良性肿瘤、甲状腺髓质 癌和小细胞肺癌。(5) 血清CgA水平可应用于前列腺癌的诊断，尤其是对于前列腺特异性抗原 (PSA)阴性或伴有远隔转移病例的诊断。CgA和PSA联合检测可提高前列腺癌诊断价值。所以，血清CgA是当今常应用于神经内分泌分化前列腺癌的较好的肿瘤 标志物。(6) 据文献报道，慢性心力衰竭患者的CgA水平增高，而且CgA增高的幅度直 接与心衰的严重程度相关。CgA是慢性心力衰竭患者死亡率的独立预示因子，如果 心力衰竭患者的CgA水平增高，则其死亡危险性相应增高。对于CgA的定量分析，目前常用的方法是免疫放射分析法(IRMA)、放射免疫 分析法(RIA)和酶联免疫吸附分析法(ELISA)，虽然免疫放射分析法和放射免疫 分析法的灵敏度高，但其存在操作复杂、测定结果不稳定、试剂保存时间短、放 射性污染等缺点；而酶联免疫吸附分析法则存在检测灵敏度不够高，检测范围窄， 影响因素较多，易造成假阴性和假阳性等缺点。因此上述方法均不能满足临床的 要求。
技术实现思路
本专利技术克服上述方法的不足，将化学发光技术与CgA的免疫分析学有效地结 合，同时使用了发光信号强、持续时间长、更高信噪比的自制化学发光底物液。 提高了检测结果的准确性，并且不会对外界产生放射性污染。本专利技术的目的在于提供一种检测精密度、灵敏度和稳定性较高，特异性和准 确性较好的嗜铬素A化学发光免疫分析定量测定试剂盒。本专利技术的嗜铬素A化学发光免疫分析定量测定试剂盒，主要由嗜铬素A抗原校准品；嗜铬素A抗体包被的固相载体；酶标记的嗜铬素A特异性抗体；酶 所作用的化学发光底物液；浓縮洗涤液组成。上述试剂盒中，所述的固相载体为微孔板或包被珠。本专利技术的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。包括以下步骤(a) 以小牛血清为基质，加入嗜铬素A配制嗜铬素A抗原校准品。(b) 用碳酸盐缓冲液与适当浓度的嗜铬素A特异性抗体混合制成包被液，并将 其负载于固相载体上，4'C放置过夜，甩去包被液后加入制备好的封闭液，室温放 置3小时甩掉封闭液，室温除湿干燥24小时。(c) 以碱性磷酸酶或者辣根过氧化物酶标记嗜铬素A特异性抗体。(d) 配制1 ， 2-二氧乙垸类衍生物或鲁米诺化学发光底物液。(e) 制备Tris-HCl或PBST浓縮洗漆液。(f) 分装上述嗜铬素A抗原校准品、酶标记的嗜铬素A特异性抗体、化学 发光底物液和浓縮洗涤液并组装为成品试剂盒。本专利技术的试剂盒采用的是"双抗体夹心一步法"反应模式，既有效地利用了 化学发光技术原理，又在酶联免疫分析的基础上应用酶催化发光底物，它不会对 外界产生放射性污染，并且灵敏度和稳定性高、特异性和准确性好，可为临床诊 断提供更为特异、快速、可靠的依据。本专利技术"嗜铬素A化学发光免疫分析定量测定试剂盒"可用于检测神经内分 泌肿瘤患者血清中的CgA水平，从而进行对神经内分泌肿瘤患者的诊断和治疗。附图说明图1为实施例1所制备的试剂盒中的校准品线性图图2为本专利技术的试剂盒同酶免试剂盒进行临床血样测值的对比具体实施例方式实施例1应用碱性磷酸酶系统制备本专利技术的嗜铬素A化学发光免疫分析定量 测定试剂盒一、碱性磷酸酶标记抗体的制备CgA特异性抗体用经典的戊二醛交联法与碱性磷酸酶偶联，用PBS缓冲液充分 透析，在结合物溶液中加入等体积的甘油并在低温冰箱(-20°C)中保存。再使用 时用20%牛血清酶稀释液进行稀释。经优化试验得出，酶标抗体的最佳工作浓度范围为1: 5000 10000。所使用的20%牛血清酶稀释液的配方为:NaH2P04'2H20 Na2HP04'12H20NaCl新生牛血清 Proclin300 食品红 去离子水1.28mM 0. 2 g8.10mM 2. 9 g150mM 8. 8 g20% 200 ml0. 1% 1.0 ml0. 05%0 1.0 ml定容至1000 mL二、 嗜铬素A抗原校准品的制备以小牛血清为基质，加入嗜铬素A配制而成，其浓度分别为0、 15、 50、 125、 250、 500ng/mL。三、 特异性抗体包被固相载体的制备。(1) 包被采用0. 05M pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液与适当浓度纯化的嗜铬素A特异性抗 体混合制成包被液，并将其负载于固相载体上；具体地，所述0.05mol/L碳酸盐缓冲液的配方为 无水碳酸钠 1.59g碳酸氢钠 2.94g去离子水 lOOOmL溶解混匀后，调整pH值至9.6，加入5.0mg嗜铬素A抗体混匀，然后加入微 孔板各孔中，每孔110"， 4'C放置过夜。(2) 封闭 封闭液的配方为-NaH2P04.2H200.2gNa2HP04.12H20 2.9g BSA 10g Proclin300 lmL双蒸水 定容至lOOOmL将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水定容，溶解混匀，调整pH值为 7. 0 7. 6。甩去包被液，将封闭液按200)aL/孔的量加入微孔板中，室温放置3小时。甩 掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时后立即进行真空封袋。留作备 用。四、化学发光底物本专利技术所使用的碱性磷酸酶(ALP)的化学发光底物液的配制方法Tris 24gNaCl 160gKC1 4gHC1 15mL双蒸水 lOOOmLProclin 300 lmLAMPPD 200mL 五、20倍浓縮洗涤液的制备配方Tris 24gNaCl 160gKC1 4gHC1 15mL去离子水 lOOOmL 调整pH值至7.4。六、分装上述半成品并组成成品试剂盒。实施例2应用辣根过氧化物酶系统制备本专利技术的嗜铬素A化学发光免疫分析 定量测定试剂盒一、辣根过氧化物酶标记抗体的制备溶解4.4mg HRP于lmL蒸馏水中，加入0.4mL过碘酸钠(5Ommol/L)室温 搅拌20min，经lmmol/L醋酸钠缓冲液，pH值为4.4本文档来自技高网...

【技术保护点】
嗜铬素Ａ化学发光免疫分析定量测定试剂盒，其特征在于，主要由嗜铬素Ａ抗原校准品；嗜铬素Ａ抗体包被的固相载体；酶标记的嗜铬素Ａ特异性抗体；化学发光底物液；浓缩洗涤液组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：任超，应希堂，胡国茂，郑金来，唐宝军，于尚永，
申请(专利权)人：北京科美东雅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]