本发明专利技术涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明专利技术提供了一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖－３（ＧＰＣ－３）化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法，实现免疫分析方法对ＧＰＣ－３ Ｎ端和Ｃ端蛋白的同时血清学检测，本试剂盒采样简单、检测方便，技术方法准确、特异。本发明专利技术采用生物素－链霉亲和素系统包被抗体，提高抗体包被的效率，提高检测线性范围，同时也能提高灵敏度，可以方便用于原发性肝癌的早期诊断或者治疗效果的追踪观察。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫分析医学领域，具体的，本专利技术提供了一种一步免疫分析方法快 速、准确、较宽范围测定磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (GPC3)的化学发光免疫分析试剂盒及 其制备方法。本试剂盒准确、真实的测定血清样本中GPC3的蛋白含量，包括N端蛋白 和C端蛋白，能够真实反映原发性肝癌病人体内肿瘤的发生、发展情况。
技术介绍
肝癌分为原发性肝癌(H印atocellular carcinoma HCC )和继发性肝癌 (Cholangiocarcinonia， Ccc)和混合型肝癌三种，其中HCC占90%以上。HCC是世界范 围内第五大常见癌症，致命率居于第三位;肝癌主要分布在非洲、东亚地区。在中国， 肝癌发病率是世界其它地区的三到四倍.HCC是乙肝、丙肝和肝硬化进一步发展而来， 症状表现为腹痛(右上部分)、腹部扩张、易产生瘀青流血和黄疸症。由于HCC经常伴 随着肝炎等肝脏疾病而误诊，发现.HCC时多为晚期，或者由于。所以需要特异的TM作为 辅助诊断标准。但是由于AFP假阳性比较高；另外30%以上的原发性肝癌(HCC)病人 AFP没有升高。所以一直以来研究人员不断寻找更特异，更灵敏的TM。如果早期能够进 行检查，可以降低HCC发生的概率或者彻底消除HCC的发生。GPC-3是很有前景肝癌肿瘤标志物。GPC-3属于连接到类肝素磷酸盐蛋白多糖上的 磷脂酰肌醇聚糖，GPC能够促进细胞生长，细胞分化和细胞迁移。报道GPC共有六种不 同的类型，在不同疾病中出现的几率不相同，因此可以表征不同的疾病。其中GPC-3mRNA 分子量2. 4kb，蛋白的分子量35 66kDa能够在HCC病人体内和黑色素瘤病人体内出现， 报道最多的是应用于HCC的诊断。在目前报道中，GPC-3是HCC诊断中最特异的标志物， 能够达到80%，既可以用于早期诊断，也可以用于治疗过程疗效的观察。另外GPC-3能 够区分良性与恶性肝脏疾病，并且GPC-3在血液中含量的变化可以反映HCC肿瘤的生长 情况。GPC-3最初检测利用它的mRNA,主要是针对体内GPC-3 raRNA含量增加进行GPC-3检 测，主要采用Northern blot、 RT-PCR、免疫组化和原位分杂交等技术,这些技术决定了 对GPC-3的测定只能是定性测定，具体的定量数据还不能得出。在原发性肝癌病人和术 后病人的组织样本中检测到GPC-3对应的mRNA含量比正常人增加了 75%。升高的GPC-3 对应raRNA也存在于血液之中，其检测的灵敏度超过了 AFP;肿瘤结块小于3cra的，灵敏度更高。但组织检测，取样复杂，检测过程耗时，不利于临床应用及推广。2003年之后GPC3抗体研究开始成熟并出现GPC-3的免疫分析技术，包括ELISA检测 技术，定量检测才开始出现，定量技术的出现有人开始研究GPC-3含量的变化与HCC发 展阶段的关系。有研究中报道，尽管血液中GPC-3蛋白含量与组织中mRNA表达情况不 呈显性相关，但血液中蛋白含量的升高及变化情况仍反映HCC的发生、发展情况，所以 能够属于血清学肿瘤标志物。有报道称主要是GPC-3蛋白的N端形式进入血液循环，有 相关报到及专利建立ELSIA方法检测血液中的N端蛋白。但后来的追踪报道表明其C 端蛋白也进入血液循环，所以先前的专利采用N端蛋白抗体进行的GPC3血清学检测准 确性受到挑战。另外GPC3蛋白含量在原发性肝癌病人血清中会有大幅度升高，能达到上千ng/ml， 所以对其检测要求检测的线性范围比较宽。
技术实现思路
(一) 需要解决的技术问题本专利技术为了满足简单、快速检测要求，为临床提供准确的诊断依据，解决了上 述问题，即取代繁琐的组织学检测，建立了准确的GPC3血清学检测方法，实现了N 端和C端蛋白的同时检测。并解决了常规微孔板包被抗体无法实现宽范围检测的要 求，即本试剂盒在灵敏的化学发光免疫分析技术平台基础上，微孔板采用链亲和素 进行修饰，然后生物素标记的抗体特异的结合在固相载体上。本专利技术的目的是提供一种GPC3血清学检测试剂盒，采用化学发光免疫分析技 术，定量，快速检测GPC3。本专利技术的另一目的是实现较宽线性范围的检测，提高试剂盒的应用范围和应用 价值。(二) 技术方案本专利技术所述检测GPC3化学发光免疫分析方法及组装试剂盒中包括GPC3标准品； GPC3多克隆抗体包被的微孔板；辣根过氧化物酶标记的GPC3单克隆抗体；发光底物夜。 本专利技术所述的GPC3化学发光免疫分析试剂盒，制备步骤如下1. 选择合适的校准品稀释液，并且以GPC-3纯品配制校准品，具体的GPC3标准品浓 度分别为0ng/ml、 10ng/ml、 50ng/ml、 150ng/ml、 500ng/ml、 1500ng/ml。2. GPC-3多克隆抗体包被微孔板，具体的步骤包括1) 链霉亲和素修饰的微孔板；2) 生物素标记GPC3多克隆抗体；3) 以生物素标记的GPC3多克隆抗体包被于链霉亲和素修饰的微孔板上；4) 封闭3. 制备辣根过氧化物酶标记的GPC-3多克隆抗体，具体的步骤包括1)将12mgHRP溶于含5mgGPC3单克隆抗体的lmlPBS(O. 1Mol/L pH6. 8)中，缓慢搅拌 下加入1%戊二醛溶液4mL，置室温3小时。2) 加入O. lmL0.2mol/L赖氨酸(0.29g溶于10mL蒸馏水)，4"C放置2h，以封闭残留 的醛基，终止反应。3) 装入透析袋，以0.01mol/L、 pH7.2 PBS, 4'C透析过夜。4) 加入等量60%甘油，小量分装，-2(TC保存。4. 配制辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物液，具体的包括-1) 基于1000mL所述化学发光底物A液，包括1. 7716g鲁米诺、0. 051g 4-羟基联苯、 0. 012g 4-碘苯硼酸、11.4g硼酸、4. 9g硼砂，其pH值为8. 0 10. 0;2) 基于1000mL所述化学发光底物B液，包括0. 329g过氧化脲、lml Tween20、 51. 58g Na2HP04 12H20、 8. 74g NaH2P04 2H20,其pH值为7. 0 7. 6。使用时A液B液1:1混合使用。5. 配制浓縮洗涤液；6. 分装个组分，并组装为成品。本专利技术"磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)化学发光免疫分析测定试剂盒" 一方面可以 准确地检测出原发性肝癌病人体内的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (GPC3)所有形式蛋白含量， 对于小肝癌患者早期诊断、早期治疗提供可靠的临床参考价值；另一方面由于使用链亲 和素-生物素之间的特异结合包被固相，因此提高的包被抗体的有效数量，既可以节省 抗体，又可以郑家包被抗体的数量，从而节省成本，实现较宽范围的线性范围。该"磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)化学发光免疫分析测定试剂盒"，酶标记的抗体 与载体上包被的抗体和被测样品的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3形成"包被抗体-抗原-抗体-酶"的夹心复合物结构，因此本专利技术采用的"双抗体夹心一步法"反应模式。本专利技术有 效地利用了化学发光技术原理，确保了检测的灵敏度。并且操作简便适用性广，既可应 用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量系统，可实现大批量快速检测，使用成本低，更易推广应用，特别适合广本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖－３（ＧＰＣ－３）化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括： １）ＧＰＣ－３校准品； ２）ＧＰＣ－３多克隆抗体包被的微孔板； ３）辣根过氧化物酶标记的抗ＧＰＣ－３单克隆抗体； ４）发光底物液； ５）浓缩洗涤液；。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张倩云，应希堂，宋胜利，胡国茂，郑金来，张坤，
申请(专利权)人：北京科美东雅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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