检测克伦特罗的化学发光免疫检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种检测克伦特罗的化学发光免疫检测试剂盒，属于免疫学检测领域。本发明专利技术的试剂盒由包被有克伦特罗－载体蛋白交联复合物的不透明白色酶标板、克伦特罗标准品、克伦特罗－过氧化物酶标记抗体、发光底物液、浓缩缓冲液组成。所述克伦特罗－载体蛋白交联复合物是将克伦特罗与载体蛋白通过混合酸酐法或直接活化蛋白法偶联得到，浓缩缓冲液含有吐温－２０缓冲液。本发明专利技术的试剂盒具有快速简便、灵敏度高、检测成本低、重复性好、高通量等优点，可用于动物尿液、血样、组织及内脏等样品中克伦特罗的残留量检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测克伦特罗的化学发光免疫检测试剂盒，用于检测动物 源性食品中如动物组织、内脏、血液、尿液和饲料、词料原料中的克伦特罗含 量或残留量。属于免疫学检测领域。
技术介绍
克伦特罗(CIenbuterol， CLB)，俗称痩肉精，是一种P-兴奋剂。因其能改 善脂肪型动物的肉与脂肪的比例，并能加速动物生长，而被广泛添加于动物饲 料中，并且可以残留在动物体内。然而这种药物对人有严重的副作用。轻则导 致心跳及心律不正常，重则可引发心脏病。目前，我国及许多国家已禁止其作 为饲料添加剂使用。在克伦特罗的检测方法方面，目前最为常用的方法包括高效液相色谱法 (HPLC)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、毛细 管电泳、酶联免疫吸附分析法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)等 方法。1、 高效液相色谱(HPLC)用于克伦特罗的检测HPLC法具有检测精确度高、假阳性率低的特点，检测克伦特罗残留的最低 检测限为l~15|ng/kg,国内已将高效液相色谱法作为检测克伦特罗残留的半确证 性方法。HPLC法的主要缺点是仪器价格昂贵、操作比较繁琐，耗时长，检测费 用昂贵；且前期样品的萃取条件的选择也对检测灵敏度和准确性有较大影响。2、 气相色谱-质谱联用(GC-MS)用于克伦特罗的检测GC-MS灵敏度很高，假阳性率低。该方法的主要缺点是样品需要衍生化这 样复杂的前期处理。虽然经过衍生化处理的样品能在质谱中给出更多的结构信 息，但是衍生化会产生多个不同的产物并导致样品的部分丢失，造成实验结果 的偏差。3、 液相色谱-质谱联用(LC-MS)用于克伦特罗的检测LC-MS对样品不需要衍生化处理，可对尿液、血液、肝脏、毛发和眼球样 品进行检测。该法对克伦特罗的最低检测限达到0.1ng/kg， LC如果与两个串联 MS联用，可进一步提高信噪比。LC-MS的缺点与GC-MS —样，操作步骤繁琐， 需要贵重仪器，所以一般用作对阳性结果的确认手段。4、 毛细管电泳用于克伦特罗的检测毛细管区带电泳法分离效率可达几百万理论塔板数，操作快速简便，所需 样品量少。但是该方法所需仪器昂贵，且可检测出克伦特罗的最低残留量达不 到其它方法的灵敏度。5、 酶联免疫吸附分析法(ELISA)用于克伦特罗的检测 酶联免疫吸附分析法是当前应用最广、发展最快的免疫酶技术之一，主要优点在于检测迅速，样品前处理简单，检测系统操作简单，成本低，同时便于 进行大规模检测。其基本原理是，将抗原(或抗体)吸附在固相载体上，酶标 记抗体(或抗原)与相应的抗原(或抗体)反应，结合在免疫复合物上的酶在 遇到相应底物时，可以催化底物水解、氧化或还原并产生有色物质，颜色的深 浅与相应的抗体(或抗原)量成正比，故可以借助成色反应的程度来定性或定 量抗体(或抗原)。ELISA检测方法主要包括双抗体夹心法、间接法、竞争法等。 双抗体夹心法主要适用于分子量较大的完全抗原，而竞争法则适用于抗原决定 位点较少的小分子量半抗原。由于克伦特罗是小分子化合物(相对分子质量小 于5000)，属于半抗原，因此常用竞争酶联免疫吸附法来测定。6、 化学发光免疫检测技术的工作原理与特点化学发光免疫检测技术不同于酶联免疫吸附分析法，它是化学发光法和免 疫分析法结合的产物，因此同时具有化学发光检测技术的高灵敏性和免疫分析 技术的高特异性。化学发光免疫分析法的基本原理与ELISA相似，不同之处在于酶标记物的 反应体系是化学发光反应。HRP (辣根过氧化物酶)和鲁米诺或其衍生物体系就 是常用的反应体系之一，在该发光体系中加入增强剂可增加化学发光强度，并在较长时间保持稳定，从而大大提高免疫分析的灵敏度。我国胥传来等(胥传 来等，分析化学研究简报，2005,33 (5) :699-702)建立的间接竞争化学发光 免疫法检测猪尿样中克伦特罗，实际检测范围为0.04~25.8ng/kg。该方法采用克 伦特罗-鸡蛋白蛋白溶液包被黑色检测板，以鸡蛋白蛋白进行封闭。检测时向包 被黑色检测板加入克伦特罗标准溶液与待测样品，然后加入克伦特罗抗体(一 抗)，室温温育30 min;然后加入辣根过氧化物酶标记的抗抗体(二抗)，再室 温温育30 min;最后加入发光底物液，并用化学发光检测仪测定发光强度。该 方法的缺点是需要同时使用一抗和二抗(其中二抗为酶标记抗体)，两种抗体加 入后都需要进行温育反应，延长了检测时间。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种检测克伦特罗的化学发 光免疫检测试剂盒。本专利技术的试剂盒具有快速简便、灵敏度高、检测成本低、 重复性好、高通量等优点，可用于动物尿液、血样、组织、内脏和饲料、饲料 原料等样品中克伦特罗的残留量检测。为实现上述目的，本专利技术主要是利用抗原与抗体的特异性免疫反应的基本 原理来实现的。化学发光免疫分析法是化学发光法和免疫分析法结合的产物， 因此同时具有化学发光法的高灵敏性和免疫分析法的高特异性。在整个反应过 程中，样品中克伦特罗含量越高，反应体系中发光强度越弱；反之，样品中克 伦特罗含量越少，发光强度越高。本专利技术是一种检测克伦特罗的化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于它含 有以下成份1、 包被有克伦特罗-载体蛋白交联复合物的不透明白色酶标板。所述克伦 特罗-载体蛋白交联复合物是将克伦特罗与载体蛋白通过混合酸酐法或直接活化 蛋白法偶联得到，所述载体蛋白为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、鸡蛋白蛋白、 鼠血清蛋白或兔血清蛋白。2、 克伦特罗标准品。3、 克伦特罗-过氧化物酶标记抗体。该成份为用过氧化物酶标记的克伦特罗抗体。所述克伦特罗抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。4、 发光底物液。该发光底物液是以鲁米诺或异鲁米诺为发光剂的化学发光 底物液，需要分为A液和B液保存，在临用前按l: l混合使用，其中A液(或B液)为鲁米诺(或异鲁米诺)以及发光增强剂，B液(或A液)为过氧化氢 溶液或尿素过氧化氢溶液。5、 浓缩缓冲液。该浓縮缓冲液的工作浓度(即蒸馏水稀释后的使用浓度) 为0.01~0.5mol/L， pH值为6.0 9.0，吐温-20的含量为0.01-0.5% (v/v)。本专利技术中，所述的不透明白色酶标板为48孔或96孔的可拆卸或不可拆卸 的不透明白色酶标板。本专利技术中，所述的克伦特罗标准品，由一系列不同浓度的克伦特罗标准品 组成，浓度范围至少包含了 0.02-3 pg/L的浓度区间。本专利技术中，所述的克伦特罗-过氧化物酶标记抗体为用过氧化物酶标记的克 伦特罗抗体，如辣根过氧化物酶标记的克伦特罗抗体。本专利技术所述的发光底物液为市售的任一种以鲁米诺或异鲁米诺为发光剂的 化学发光底物液。所述的浓縮缓冲液，为含有吐温-20 (Tween-20)缓冲液的2~100倍浓縮液， 该缓冲液可以是磷酸缓冲液(PBST)、甘氨酸-HCl缓冲液或Tris-HCl缓冲液， 使用前用蒸馏水稀释至工作浓度后使用。本专利技术的试剂盒应用于克伦特罗的检测时，检测步骤为1) 样品前处理。2) 将本专利技术的试剂盒(含酶标板、标准品、浓縮缓冲液、克伦特罗-过氧 化物酶标记抗体、发光底物溶液)从冰箱取出，置于室温下，回温 10隱60min。3) 工作浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测克伦特罗的化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于含有以下成份：　１）包被有克伦特罗－载体蛋白交联复合物的不透明白色酶标板；所述克伦特罗－载体蛋白交联复合物是将克伦特罗与载体蛋白通过混合酸酐法或直接活化蛋白法偶联得到，所述载体蛋白为 人血清白蛋白、牛血清白蛋白、鸡蛋白蛋白、鼠血清蛋白或兔血清蛋白；　２）克伦特罗标准品；　３）克伦特罗－过氧化物酶标记抗体；该成份为用过氧化物酶标记的克伦特罗抗体，所述克伦特罗抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；　４）发光底物液； 该发光底物液是以鲁米诺或异鲁米诺为发光剂的化学发光底物液，分为Ａ液和Ｂ液保存，在临用前按１∶１混合使用，其中Ａ液为发光增强剂加鲁米诺或发光增强剂加异鲁米诺，Ｂ液为过氧化氢溶液或尿素过氧化氢溶液；　５）浓缩缓冲液，其工作浓度为０．０１～ ０．５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值为６．０～９．０，吐温－２０的体积含量为０．０１～０．５％。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈峰，徐晓婴，卢庆鋆，梁晓翠，卢永红，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]