检测链霉素药物残留的胶体金试纸卡制造技术

本实用新型专利技术提供了一种检测试纸卡，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，结合物释放垫的部分区域覆盖于样品吸收垫之下。在反应膜层上具备包被有链霉素－载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠ＩｇＧ构成指质控线；结合物释放垫包被有链霉素的胶体金标记物。采用本实用新型专利技术试纸卡是可以延长检测结果观察时间，样品吸收垫也可以将检测液体充分吸收与金标抗体完全接触充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差。还可以防止检测样本中一些干扰成份使金标抗体中的蛋白失去活性，影响金标抗体与包被原的结合。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术属于兽药残留的免疫化学速测
，具体涉及一 种检测试纸卡。
技术介绍
链霉素(Streptomycin)是氨基糖甙类抗生素，被广范应用于动 物疾病的治疗，由于其具有神经毒性和肾脏毒性，能选择性的损害 第8对脑神经，导致前庭和耳蜗神经损伤。肾毒性主要表现为近端 肾曲管损伤，出现蛋白尿、血尿、肾功能减退等，婴儿对氨基糖甙 类抗生素敏感，氨基糖甙类抗生素能透过胎盘损害胎儿听觉，毒副 作用和容易产成的耐药性。在动物食品中的残留会影响人类健康， 欧美国家及我国均要求其限量使用。目前链霉素残留常用的检测方法有两种。 一种是色谱分析，如气 相色谱法(GC)，由于复杂的仪器设备和繁瑣的过程，不适合现场监 控和大量样本筛查。另一种为免疫学方法，如酶联免疫吸附法 (ELISA)。它的缺点是检测时间长，费用较高，不利于在基层单位 推广使用。而且，这两种方法都需要专业技术人员进行操作。
技术实现思路
本技术的目的在于针对上述不足提供一种敏感度高、成本 低、操作简单、检测时间短的试纸卡。本技术的试纸卡包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样 品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，与常规试纸卡不同的是， 其中的结合物释放垫不是完全覆盖在样品吸收垫之下，而是部分区域覆盖于样品吸收垫之下，优选结合物释放垫的二分之一至三分之一区 域覆盖于样品吸收垫之下。这样做的好处是可以延长检测结果观察时间，样品吸收垫也可以将检测液体充分吸收与金标抗体完全接触充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差。还可以防止检测样本中一些干扰 成份使金标抗体中的蛋白失去活性，影响金标抗体与包被原的结合。所述反应膜上分别包被有链霉素-载体蛋白偶联物构成的检测线 印迹"I "和包被羊抗鼠IgG构成的质控线印迹"I "。从而可以用于链霉素残留的检测。本技术试纸卡的底板为可PVC板或者是其它硬质而不吸水的材料；反应膜可为硝酸纤维素膜或者醋酸纤维素膜；样品吸收垫可由玻璃棉或聚酯材料制成；结合物释放垫可由纤维制成，结合物释放 垫层包被有抗体-胶体金结合物。在样品吸收垫与结合物释放垫及吸水层上覆盖有保护膜，在玻璃棉和纤维层一侧约0.4cm处喷制样品标 记线。偶联链霉素载体蛋白可用卵血清蛋白、或人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蓝蛋白等，在反应膜上的检测线印迹和质控线的对照印迹组合排列可为"II"本技术试纸卡具有如下有益效果l.特异性强，敏感度高。链霉素快速检测试纸卡以胶体金标记高亲和力的单克隆为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，快速检测纸卡具有较高的特异性和敏感性。可检测10ng/ml。2.操作简便快速。使用快速检测试纸卡时无需任何其它试剂，只要将样品用滴管滴入试剂卡孔内，滴加3滴(约IOO微升)，加后计时，5~8min内观察结果。3.显示检测结果形象、直观准确。快速检测试纸卡以显示红线色 "I "及"II ，，印迹作为检测线的阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上显示一条红线"I "印迹表示在被检测样品液中含有链霉素，两条红线"ll"印迹表示在被检测样品中不含链霉素，结果判定形象、直观、准 确、简单明了，不容易出现阴性和假阳性误判。4. 成本低，投资少。使用快速检测试纸条，不需另配仪器设备及 其他试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。5. 易于大范围推广应用。快速检测试纸卡操作简单，人人都操作， 能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、海关检疫、卫生防疫、 质量监测、动物产品加工、集化养殖到个体养殖等，具有广阔的巿场 前景和较大的经济、社会效益。附图说明图l为链霉素快速检测试纸卡结构示意图，其中，1、样品吸收垫; 2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、检测线；6、质控线； 7、底板；图2为链霉素快速检测试纸卡俯视结构示意图，其中8-l和8-2是 覆盖在试纸卡两端的保护膜，9为标记线；图3为链霉素快速检测试纸卡阴性(图3,a)、阳性(图3.b)、无效 (图3.c)显色示意图，其中T质控区，C为检测区。具体实施方式实施例l试纸卡的组装参见图l、图2:样品吸收垫l用玻璃棉制成，结合物释放垫层2 为吸附有链霉素的金标载体蛋白标记物的纤维层，根据可按下面制备 方法，制备包被有链霉素金标抗体纤维层，简称链霉素胶体金标记物， 3为反应膜层，本实施例采用硝酸纤维素膜，4吸水垫为吸水材料层 制成，5为检测区包被有链霉素-载体蛋白偶联物，6为质控区包被有 羊抗鼠IgG构成指质控线，7为PVC背衬为支持层，用塑料薄片条制成， 在PVC背衬上按顺序粘附硝酸纤维素膜、吸水垫、结合物释放垫和样 本垫，将样本垫覆盖在结合物释放垫三分之一处，8-l为白色保护膜， 覆盖在样品吸收垫和结合物释放垫上，在样品吸收垫和结合物释放垫交界处对应保护膜8-l位置偏向于样品吸收垫一方0.5cm处印有标记线9, 9的右端印有箭头及max字样，滤纸层4即为吸水层(手柄端) 上覆盖有浅蓝色保护膜8-2。要制成链霉素快速检测试纸卡首先需制备偶联链霉素载体蛋白， 制备检测线，制备胶体金，用于制备金标抗体纤维，其次须制备羊抗鼠IgG抗体，用于制作质控线。以下是相关材料的制备方法1. 链霉素载体蛋白的偶联取EDC50mg,用pH8.0的10mmoL/L PBS液1.5mL使之充分溶解(I液)。取链霉素58mg，用双蒸水2mL溶液(II液)。取OVA48mg，溶于3mL10mmoL/LPBS ( pH8.0 )液中(III液)。将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液(余下0.5mL)。室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液。4度搅拌12小时。静置10小时(4度)。用蒸馏水使之充分透析(约48小时)。1.2链霉素-载体偶联物的鉴定将载体蛋白、链霉素半抗原、链霉素-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH7.4 PBS调零，用紫外分光光度计在波长200-800 nm范围内扫描，得到载体蛋白、链霉素半抗原、链霉素-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明链霉素与载体蛋白偶联成功。2. 抗链霉素克隆抗体的制备2.1动物免疫将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为80μg/只，使其产生多克隆抗体。细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5:1 比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，釆用间接竟争ELISA法测定细胞上 清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直接到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2.2细胞冻存和复苏将链霉素的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成lxl()S个/ml的细 胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37。C水 浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。 2.3单克隆抗体的制备与纯化将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.4ml/只，7天后腹腔注射链 霉素的单克隆杂交瘤细胞株5><105个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入-20'C环境保存。3.链霉素金标抗体和金标标记物的制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测链霉素药物残留的胶体金试纸卡，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，其特征在于，结合物释放垫的二分之一至三分之一区域覆盖于样品吸收垫之下。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何方洋，沈建忠，万宇平，冯才伟，冯才茂，赵正苗，吴小平，朱亮，汪善良，
申请(专利权)人：北京望尔生物技术有限公司，北京望尔康泰生物技术有限公司，
类型：实用新型
国别省市：11[中国|北京]