一种硝西泮胶体金法检测试纸及制备方法技术

一种硝西泮胶体金法检测试纸及制备方法，属于生物学免疫方法的测定技术领域。本发明专利技术检测试纸由样品垫、结合释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和塑料底板组成，塑料底板上依次粘贴样品垫、结合释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，结合释放垫上包被了抗硝西泮多抗－胶体金标记物，硝酸纤维素膜上依次包被有硝西泮偶联抗原和羊抗兔ＩｇＧ抗体，以硝西泮偶联抗原作为测试线，以羊抗兔ＩｇＧ抗体作为质控线。本发明专利技术具有使用方便、经济快捷、制作容易、成本低廉的特点。

【技术实现步骤摘要】

，属于生物学免疫方法的测定技 术领域。技术背景硝西泮(Nitmzepam)为苯二氮卓类镇静安眠药，化学名称为1，3-二氢-7-硝基 -5-苯基-2H-l，4-苯并二氮卓-2-酮。曾用作动物饲料添加剂，作为生长促进剂，具 有使动物嗜睡少动，生长快且有改变肉质的作用。也用在屠宰和动物检疫之前, 或将动物转移屠宰之前，起镇静作用，以减轻动物紧张状态，降低动物伤害和死 亡率。此类药物常见嗜睡，可见无力、头痛、晕眩、恶心、便秘，偶见皮疹、肝 损害、骨髓抑制等不良反应。若随意在饲料中添加此类药物，蓄积的药物通过食 物链进入人体，将造成巨大的危害。为此许多国家将此类药物列入禁用药物名 单。目前，国内外有关硝西泮的检测主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱 法(GC)、薄层色谱法(TLC)、气-质联用法(GC-MS)、液-质联用法(LC -MS)等， 但这些方法不仅需要昂贵的仪器设备，对检材的要求也比较高，需要进一步的 提纯处理才能进行，且不能适应高通量、现场的快速检测。因此实现具有快速， 便携优点的免疫检测方法的多残留检测具有现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，为了克服 现有检测技术的缺陷，提供一种便携，快速适合进行现场检测硝西泮的免疫层 析色谱检领鹏(gold immunochromatogmphy assay; GICA)。本专利技术的技术方案 一种硝西泮胶体金法检测试纸，由样品垫、结合释放 垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和塑料底板组成，塑料底板上依次粘贴样品垫、结 合释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，结合释放垫上包被了抗硝西泮多抗-胶体金 标记物，硝酸纤维素膜上依次包被有硝西泮偶联抗原和羊抗兔IgG抗体，以硝西泮偶联抗原作为测试线，以羊抗兔IgG抗体作为质控线。制备步骤为(1) 将硝西泮与牛血清蛋白分子进行偶联，作为硝西泮偶联抗原；(2) 用硝西泮偶联抗原按常规方法免疫制得抗硝西泮多抗；(3) 用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm胶体金颗粒；(4) 将3mL胶体金调至pH 9，搅拌下逐滴加入蛋白浓度为0.2mg/mL的抗硝 西泮多抗0.02mL，放置30min后加入5%牛血清蛋白BSA溶液使终浓度为1%，放置至少30min后，IOOOO转离心50min，移去上清液后用含5%蔗糖的0.002mol/L pH9.0的硼酸盐缓冲液3mL重悬，重复2次，最后用0.3mL缓冲液溶解，得到 稳定的抗硝西泮多抗-胶体金标记物；(5) 将抗硝西泮多抗-胶体金标记物包被在胶体金结合释放垫上，将硝西泮偶 联抗原和羊抗兔IgG抗体依此分别包被在硝酸纤维素膜上，硝西泮偶联抗原作 为测试线和羊抗兔IgG抗体作为质控线，在37'C烘箱干燥；(6) 试纸条的组装将样品垫、结合释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫由一端 依次黏附在塑料底板上，即得到用于免疫检测的硝西泮胶体金法检测试纸。本专利技术检测原理是利用样品垫形成的毛细管虹吸效应，使被检测物质首先 与胶体金标记的抗硝西泮多抗发生竞争形式的结合，其后果是，当胶体金标记 的抗硝西泮多抗过量时，多余的多抗漂移到测试线，与硝西泮偶联抗原结合并 显色；而与检测物结合的胶体金标记的抗硝西泮多抗，其V区结合位点被检测 物质占据，只能跨越测试线漂移到质控线以C区位点与羊抗兔IgG抗体非特异 性结合，同测试线进行比色而得到检测结果。本专利技术的有益效果本专利技术应用层析式一步竞争法原理，试纸中上下线比 色来半定量检测血清或尿液样品中的硝西泮残留量，在5-10min内，快速准确地 检测出样品是否含有硝西泮，以确定硝西泮是否超标，能够满足食品安全对硝 西泮残留量检测需求，适用于屠宰企业及政府检测机构。本专利技术与现有技术相比，其效果不言而喻，即具有使用方便、经济快捷、 制作容易、成本低廉的特点。 附图说明图1本专利技术硝西泮胶体金法检测试纸的侧视图。具体实施方式实施例l:硝西泮检测试纸的制备(1) 将硝西泮与牛血清蛋白分子偶联，作为硝西泮偶联抗原，(2) 用硝西泮偶联抗原免疫获得抗硝西泮多抗(3) 用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm胶体金颗粒；(4) 将3mL胶体金调至pH 9，搅拌下逐滴加入蛋白浓度为0.2mg/mL的抗硝 西泮多抗0.02mL，放置30min后加入5。/。牛血清白蛋白(BSA)溶液使终浓度为 1%,放置至少30min后，10000转离心50min，移去上清液后用0.002mol/LpH 9.0 的硼酸盐缓冲液(含5M蔗糖)3mL重悬解，重复2次，最后用0.3mL缓冲液溶解， 得到稳定的抗硝西泮多抗-胶体金标记物；(5) 将抗硝西泮多抗-胶体金标记物包被在胶体金结合释放垫上，将硝西泮偶 联抗原和羊抗兔IgG抗体依次分别包被在硝酸纤维素膜上，硝西泮偶联抗原作 为(6)试纸条的组装将样品垫、结合释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫由一端 依次黏附在塑料底板上，即得到用于检测的免疫层析试纸条。 实施例2:试纸要求 (l)阴性参考品符合率用磷酸盐缓冲液(PBS: 0.01mol/L、 pH7.4)配制浓度为10ng/mL的盐酸异丙 嗪标准品溶液进行10次平行检测，以正常或矫正目力观察结果，反应时间在 5min时观察结果，应为阴性。用磷酸盐缓冲液(PBS: 0.01mol/L、 pH7.4)配制浓度为10ng/mL的巴比妥标 准品溶液进行10次平行检测，以正常或矫正目力观察结果，反应时间在5min 时观察结果，应为阴性。P)阳性参考品符合率用磷酸盐缓冲液(PBS: 0.01mol/L、 pH 7.4)配制浓度为10、 50、 100ng/mL 的硝西泮标准品进行平行检测，各浓度进行10次平行实验，反应时间在5min 时观察结果，不得出现阴性。(3)最低检出量用磷酸盐缓冲液(PBS: 0.01mol/L、 pH 7.4)分别配制浓度为0、 2、 5、 10、 20、 50、 100ng/mL的硝西泮标准品溶液，各浓度进行10次平行实验，反应时间 在5min时，以正常或矫正目力观察结果，最低检出量不高于5ng/mL。H)再现性用磷酸盐缓冲液(PBS: 0.01mol/L、 pH7.4)分别配制浓度为10ng/mL的硝西 泮标准品溶液，进行10次平行实验，反应时间在5min时，以正常或矫正目力 观察结果，结果一致，显色度均一。(5)稳定性测试37"C放置10天后，各项指标应符合以上要求。 实施例3:试纸使用方法(1) 样品制备血清抽取待检动物血液，离心或静置后取透明上清液使用；若血清有过 度溶血现象，将血清用蒸馏水稀释一倍后再进行实验，否则试剂片红色太深， 影响测试结果。尿液用尿液直接进行测试，如浑浊，先离心取上清液或以蒸馏水l : l稀释。(2) 操作将试纸箭头端浸泡在待测样本中，不要超过样品垫lcm。浸入30sec取出放 平，10min读取结果。(3) 检测结果阴性两条带都显色，且测试线颜色深于质控线颜色，说明样品中不含硝西泮。 两条带都显色，且测试线颜色与质控线颜色相同或接近，说明样品的硝西泮含量低于5ppb(5ng/mL)。阳性 两条带都显色，但测试线颜色浅于质控线颜色，说明检测样品中硝西泮含量超过5ppb(5ng/mL)。测试线不显色，质控线显色，说明样品中的硝西泮含量高于 10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种硝西泮胶体金法检测试纸，其特征在于由样品垫、结合释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和塑料底板组成，塑料底板上依次粘贴样品垫、结合释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，结合释放垫上包被了抗硝西泮多抗－胶体金标记物，硝酸纤维素膜上依次包被有硝西泮偶联抗原和羊抗兔ＩｇＧ抗体，以硝西泮偶联抗原作为测试线，以羊抗兔ＩｇＧ抗体作为质控线。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，李秋生，刘丽强，袁缓，彭池方，胡拥明，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]