本发明专利技术涉及免疫测定液体检样中特异抗体的方法，其中，使检液在一种固相存在下，用两种针对待检测抗体的抗原温育，第一种抗原带有至少一个标识基团，第二个抗原（ａ）结合在固相上或（ｂ）以可与固相结合的形式存在，通过测定固相或和液相中的标识基团，来检测出待测抗体，其特征在于，两个抗原中至少一个含有多重抗原决定簇，它与待检测抗体反应。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用含有多个抗原决定部分的抗原来测定特异的免疫球蛋白的方法。检查体液中、尤其是人血清中的免疫球蛋白可用于诊断微生物感染，尤其是病毒例如HIV、肝炎病毒等的感染。在受检样品中存在的特异的免疫球蛋白，常规检查的方法是通过与该特异的免疫球蛋白发生反应的一个或多个抗原、在检液中测定特异的免疫球蛋白的方法必须灵敏、可靠、简便和快捷。近年来，日渐发展了基于非放射性标记基团的检查系统，此时检查中存在的特异的抗体可借助光学(例如发光或荧光)、NMR或金属沉淀检测系统进行测定。EP-A-0307149公布了抗体的免疫测定方法，是用两个重组的多肽作为抗原，其中一个多肽固定在固相上，另一多肽则携带一标识基，两个重组的抗原取自不同的生物，以便提高鉴别的特异性。EP-A-0366673公布了测定样品中抗体的方法，是将抗体与一纯化的标识的抗原和纯化的与固相结合的抗原进行反应。用作抗原的例如是人的IgG。EP-A-0386713叙述了鉴别HIV抗体的方法，是用两个固体载体，固定在两个固体载体上的是不同的HIV-抗原，它与检样的等分液和被标识的HIV-抗体相接触，此时若有抗体存在时，至少有一个检样有阳性反应。重组方法制备的多肽作为HIV-抗原。EP-A-0507586叙述了免疫方法测定特异的免疫球蛋白的方法，即一个检样与两个能与免疫球蛋白结合的抗原相接触而反应，第一个抗原携带有结合在固体载体上的适宜的基团，第二个抗原携带有标识基团。标识基团可以是直接的标识基团，例如酶、发色团、金属粒子，也可以是间接的标识基团，后者携带有可产生信号的基团。间接识别基团的一个实例可提及荧光素衍生物，它的受体是一个抗体，该抗体又与一酶偶联。多肽可作为抗原，例如乙肝表面抗原。该抗原可衍生化引入SH-基，再与荧光素偶联。EP-A-0507587公布了特异地鉴别IgM抗体的适宜方法，即将检样与被标识的、针对要检出的抗体的抗原和与第二个也针对要检出的抗体的、与固相连结的抗原共同温育。根据桥连测定概念的已知免疫鉴别方法，是用标识的抗原和可结合在固相的抗原，它仍有明显的弱点。当被测定的抗体和抗原之间有较小的亲和力时，尤其是有较小的灵敏度。这特别是只有短时间的血清转化或感染的微生物出现新的亚型。迄今已知的桥连测定概念的另一缺点是由于Hook效应对于高滴度的检样有假阴性的危险。基于这些问题，本专利技术提出了鉴别特异抗体的方法，其中现有技术方法的上述缺点至少部分地被克服了，尤其是对直到前不久才实现的血清转化和新的微生物亚型有足够的灵敏性。此外，本专利技术方法的Hook效应可达到最小。解决这个问题所用的方法是，在检液中免疫测定特异的抗体，该检液在固相的存在下与两个针对待测定的抗体的抗原相温育，第一个抗原至少携带一个标识基团，第二个抗原(a)连结在固相上，或(b)是以能与固相连结的形式存在，待测定的抗体经测定固相上和/或在液相中的标识基团而被鉴定出，其特征是，两个抗体中的至少一个含有多个抗原决定部分，后者与待测定的抗体进行反应。令人意外的是，在用至少一个多重抗原进行桥连免疫测定时，即用有多重抗原决定部分的抗原时，对于血清中对所用的抗原有较小亲和力的抗体的检测灵敏度可改善。此外，本专利技术方法还显著地减低了因Hook效应而使高滴度检样造成假阴性的危险。经提高桥连测定概念的抗原决定簇的密度而优化了抗原的表达，通常会改善多克隆血清中特异的免疫球蛋白的反应性，如使用检液血清那样。本专利技术方法的另一优点是，多重抗原比单抗原的稳定性明显地改善了。根据桥连测定概念，对特异抗体进行免疫测定的方法需要有两个抗原。本专利技术的第一个优选的实施形式是用多重抗原作为标识抗原，而单抗原作为固相的抗原。本专利技术的第二个实施形式是，用多重抗原作为固相抗原，单抗原作为标识的抗原。第三个优选的实施形式是，用多重抗原作为被标识的抗原和固相抗原。多重抗原含有多个抗原决定部分，即具有免疫学上与特定的抗体反应的结构，优选为肽或多肽序列。该抗原决定部分优选经免疫非活性区段(例如间隔区域)相互连接。优选用的多重抗原包含有多个相同的抗原决定簇。本专利技术的多重抗原优选含有多于1个到80个免疫活性的抗原决定区域，尤其优选为多于1个到40个抗原决定区域。该抗原决定区域可以用高分子载体偶联，或经间隔基间接与之相互偶联。抗原决定区域优选是有免疫活性的合成肽，序列的长度为6-50个氨基酸，或是重组多肽，序列的长度优选直到1000个氨基酸。合成的肽抗原决定基除含特定的抗原决定簇外，最好有间隔基，该间隔基例如用于与其它抗原决定基或载体偶联，或者和与标识基或固相结合基偶联。间隔基优选的免疫非活性的肽，序列长度为1-10个氨基酸。间隔基的氨基酸优选自甘氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸，∈-氨基己酸，赖氨酸，以及H2Nx-CH2CH2COOH的化合物，n为2或3，x为1-10。间隔基最好是在抗原决定簇的氨基端或/和羧基端的氨基酸的连续序列。按照桥连测定概念进行免疫测定时，用第一个标识的抗原。本专利技术方法可以用各种已知的标识基团，例如放射活性的和非放射活性的标识基。优选的非放射性标识基团可直接或/和间接地检出。直接可检测的标识基是定位在抗原上的可直接产生测定信号的基团。这些可直接产生信号的基团的实例是生色团(荧光或发光基团，染料)，酶，NMR-活性基团或金属粒子，这些可用已知方法偶联到肽或多肽抗原上。优选的直接可测定的标识基团是通过荧光或电化学发光来检测的金属螯合物，尤其优选为钌、铼、铱或锇螯合物，特别是钌螯合物，例如钌-(二吡啶)32+-螯合物。其它适宜的金属螯合物-标识基例如叙述于EP-A-0580979，WO90/05301，WO90/11511和WO92/14138。本专利技术提及这些文件并将相关内容并入本专利技术。本专利技术的另一种标识基团是间接的可检查的标识基团，此时抗原与间接的可检出的基团偶联，例如生物素或半抗原基团，后者又与适宜的结合配对相反应(抗生物素蛋白链菌素、抗生物素蛋白或抗半抗原-抗体)，后者又携带可产生信号的基团。优选的间接的标识基团作为半抗原时，用分子量为100～2000的有机分子，优选用分子量为150～1000。该半抗原是能够与特异受体结合的半抗原。受体的实例是抗体，抗体片断，后者可针对半抗原，或者是与半抗原作特异结合的物质，例如当半抗原是生物素时，为抗生物素蛋白链菌素或抗生物素蛋白。优选的半抗原可选自甾类，没食子酸，性激素，皮质素，强心甙元，强心甙，蟾蜍二烯木脂素，甾体-皂甙元，甾体生物碱，尤其优选的半抗原是强心甙元和强心甙，这类物质的代表是洋地黄甙，洋地黄毒甙，地高辛甙元，毒毛旋花子甙原，地高辛，洋地黄毒甙，地妥辛和毒毛旋花子甙，其中特别优选的是地高辛甙元和地高辛。另一个适宜的半抗原例如是荧光素或适宜的荧光素衍生物。半抗原的受体与能产生信号的基团相偶联，优选为酶，如某些过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，脲酶或Q-β-复制酶。产生信号的基团也可以是生色团、放射性基团或NMR活性基团或是金属粒子(如金)。半抗原与抗原偶联例如可以这样进行，将半抗原以活化酯衍生物的形式偶联到肽或多肽抗原的氨基末端或羧基末端。本专利技术的“活化酯”的含义是活化的酯基，它在如下的条件下可与肽的游离氨基反应，而不与肽中其它活性基团发生干扰性的副反本文档来自技高网...
【技术保护点】
免疫测定检液中特异抗体的方法，在固相的存在下，该检液用针对待测定的抗体的两个抗原温育，第一个抗原至少带有一个标识基，第二个抗原（ａ）结合于固相上、或（ｂ）是可与固相结合的形式，通过测定固相上的或／和液相中的标识基，鉴别出待测定的抗体，其特征是，两个抗原中的至少一个抗原含有可与待测定的抗体发生反应的多重抗原决定簇。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：UH维恩赫斯，C克鲁斯穆勒，E霍斯，E法特兹，B奥恩罗哈恩勒，C瑟德尔，M维德曼，
申请(专利权)人：罗切诊断学有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。