压电基因诊断实时定量分析方法与仪器技术

本发明专利技术的压电基因诊断实时定量分析方法与仪器属于基因的体外检测方法和实施该方法的仪器。旨在解决已有技术准确性差、操作繁杂等问题。本方法是采用压电基因诊断芯片和频率检测仪，利用多重ＰＣＲ技术进行杂交－延伸－变性的温度循环扩增靶基因，监测并获得频率变化与靶基因浓度的的线性关系，再用外标准曲线进行定量分析。本仪器包含壳体、电源及其相联接的电路和主板模块、分析软件、样品制备模块、定位液流模块、压电基因诊断芯片检测模块。适于临床疾病诊断及分子机理的研究、监测流行病和传染病扩散、有害微生物的发生和扩散等。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于体外基因检测方法和实施该方法的仪器。
技术介绍
绝大多数疾病的发生发展都与患者遗传背景或者其改变有关，基因诊断是指运用基因分析对疾病做出诊断的方法。基因诊断的对象首先是病原生物的侵入，直接检测病原生物的遗传物质可以大大提高诊断的敏感性和特异性，而且在无法得到商业化抗体时，基因诊断就成为检测病原微生物感染，尤其是病毒感染的唯一手段；其次是先天遗传性疾患，一些发病原因确定的遗传性疾患和其它病因尚不清楚的疾病都可能与某个或某些基因的持有或改变有关；再者是后天基因突变引起的疾病，例如肿瘤的发生可以初步认为是由于个别细胞基因如抑癌基因或癌基因发生突变而引起的细胞无限增殖；其它如DNA指纹、个体识别、亲子关系识别、法医物证等。基因诊断不仅对临床诊断，而且对疾病的病因和发病机理的研究、为病人检测疗效，分析愈后，客观正确地评价人体的健康状况都具有重要的意义。基因诊断技术的应用，使许多疑难病的诊断变得简便、精确，避免了临床上有些病症靠经验指导治疗的盲目性，达到了最早、最有效、最经济的治疗目的。但是基因样品的缺乏是进行基因诊断的一大障碍。聚合酶链式反应(PCR)技术的问世，为此提供了有效的手段。PCR技术是利用热稳定的DNA合成酶-Taq多聚酶在体外合成DNA片段，通过反复循环的DNA变性、退火和延伸，可使靶DNA得到大量扩增。PCR扩增DNA片段只是一个重要手段，扩增片段的检测和分析才是目的，因此，PCR扩增后根据研究对象和目的的不同而主要采用以下两种分析方法凝胶电泳分析法通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后用溴化乙淀染色，于UV灯下观察结果并拍照。凝胶电泳可以鉴定产物的大小，检测扩增的情况。斑点杂交法首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，再用放射性或非放射性标记物标记的探针杂交。斑点杂交法有助于检测突变DNA的突变类型，用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。PCR技术用于定量基因诊断还需采用特定的方法。《中华检验医学杂志》2000，23(2):120-121发表的“定量聚合酶链反应的研究进展与临床应用”文章，综述了几种传统定量PCR方法，主要包括内标法在不同的PCR反应管中加入已定量的人工合成内标和-对引物(其一为荧光标记)，在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量检测模板。PCR-ELISA法利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再与加入的酶标抗地高辛或抗生物素结合，最终酶使底物显色。常规的PCR-ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。但上述传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，由于在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，PCR反应中存在内标与模板之间的干扰和竞争，尤其当两者的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。另外由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。因此，传统定量方法虽然加入内标，但实际上仍然只是一种半定量的方法。为此，实时荧光定量PCR技术于1996年提出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。美国Applied Biosystems公司1999年公开的“DNA/RNA Real-Time Quantitative PCR-Rev.A&B”报告，介绍了实时荧光定量PCR技术的原理和特点。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR成功的一个关键是采用特殊的荧光探针实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度。在该技术中，将PCR反应的前15个循环的荧光信号即荧光本底信号作为荧光域值，每个反应管内(即每个模板)的荧光信号到达域值时所经历的循环数(Ct)与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。与传统PCR的内标定量方法比较，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。由于PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期(对数期)，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性较好，大大提高了定量的准确性和重现性。另外，近年出现的基因芯片技术也可望应用于基因诊断。基因芯片技术是指将大量基因探针分子(基因探针阵列)固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息，实现对基因的准确、快速、大信息量的检测。基因芯片技术解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的基因诊断应用。《生物工程进展》1999,Vol.19(No.4)45-51发表的“基因芯片技术及应用研究进展”文章，综述了国内外对基因芯片技术在加工制备、功能和应用方面的主要研究成果。现有基因芯片技术一方面基因芯片的制备主要是采用固相原位合成结合照相平板印刷的技术在玻璃片等载体上合成、固定探针分子阵列；另一方面基因芯片的检测主要是利用荧光素等标记靶基因，借助激光共聚焦显微扫描技术或电荷藕合器件摄像技术对基因芯片上杂交靶基因的荧光信号进行检测和分析。上述实时荧光定量PCR和基因芯片技术，一方面，均是采用荧光检测，需要大型复杂、精密昂贵的检测设备，同时需要较长时间(3-4小时)，即需在多次(15次以上)扩增循环后，或完成杂交反应后进行检测，而且影响分析结果准确性的因素较多，难以控制把握，易产生假阳性结果，并且需对靶基因或探针进行荧光标记，增加了消耗试剂成本；另一方面，一次分析过程包括多步操作，尤其是包括样品预处理、靶基因获取和标记等，操作繁琐，整个分析系统难以集成化、自动化和小型化。这些缺陷是目前推广普及基因诊断技术的难以逾越的障碍。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术的目的是针对现有基因诊断技术存在的上述问题，提供一种准确灵敏、快速高效、自动简便、成本低廉的压电基因诊断实时定量分析方法与仪器。为达上述目的，本专利技术利用多重PCR技术同时扩增多种靶基因，采用基因探针诊断技术与压电传感器芯片技术相结合的压电基因诊断芯片，同时识别杂交多种靶基因，并实时获取各个探针一靶基因杂交的反应信息，以准确灵敏、快速高效、简便价廉地进行基因诊断的分析；另一方面，本专利技术将样品处理、进样检测、结果分析等基因诊断分析过程的各个模块集成于一个系统，构建压电基因诊断实时定量分析仪器，采用微机和特定程序，以自动控制进行基因诊断定量分析的各个环节，并动态显示本文档来自技高网...

【技术保护点】
压电基因诊断实时定量分析方法，其特征在于采用压电基因诊断芯片和频率检测仪，在压电基因诊断芯片的电极阵列上固定有至少一种疾病基因的探针，将已加入含至少一种靶基因的引物、Ｔａｑ－ＤＮＡ多聚酶、三磷酸脱氧核苷的基因诊断试剂的样品与压电基因诊断芯片接触，进行杂交一延伸一变性的温度循环，其杂交温度为３０－７０℃，延伸温度为６５－８０℃，变性温度为８５－９９℃，温度循环的起点为变性温度１０－６０秒，然后杂交温度１０－６０秒，终点为延伸温度１０－６０秒；在杂交阶段，靶基因与探针、引物基于序列互补进行杂交结合，在延伸阶段，杂交的探针和引物以靶基因为模板在Ｔａｑ－ＤＮＡ多聚酶的催化作用下进行多聚酶链反应，使探针和引物得到延伸，在变性阶段，探针－靶基因、引物－靶基因杂合物解离，随温度循环次数的增加，样品中靶基因浓度增大，与探针结合的靶基因量扩增，使电极表面质量增加而各检测位点的频率发生变化，在温度循环全过程中监测频率变化，将第一个杂交阶段的频率变化即本底噪声设置为频率变化的域值，当频率变化超过域值时，停止温度循环，根据频率变化达到域值所需的循环次数与样品中靶基因浓度的对数存在的线性关系，用外标准曲线对靶基因进行定量分析。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：莫志宏，吴中福，靳萍，田学隆，郭刚，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]