基因芯片用人类白细胞抗原分型探针的筛选及其应用方法技术

本发明专利技术公开了一种人类白细胞抗原高分辨率、并且探针调试以及确定判定阀值容易的分型探针筛选及其应用方法，提出了对多态性位点进行“分组”的解决方案，依此方法设计出来的分型探针，检测位点定位准确并且包容性较强，分辨率高。本发明专利技术的全部筛选过程全部由设计的一套计算机软件来执行，所以，可以快速准确地筛选出理想的分型探针。而且本专利还描述了各种匹配关系表的构建方法及如何根据这些匹配关系表一步步由芯片杂交结果判断出待测样品的白细胞抗原类型，解决了该分型探针在实际工作中的应用问题。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种人类白细胞抗原类型的测试鉴别方法，特别涉及用于基因芯片检测方面的分型探针筛选和应用的方法。
技术介绍
人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen，简称HLA)就是人类的主要组织相容性复合物(Major HistocompatibilityComplex简称MHC)，它在免疫系统中对T细胞发育阶段中的筛选、效应阶段中的活性介导以及对NK细胞的抑制等方面发挥非常重要的作用。人类白细胞抗原具有非常丰富的多态性，即在一个人群当中，对于同一种白细胞抗原，不同的个体可能携带有不同的等位基因。以2003年4月份IMGT/HLA公布的资料为例，HLA-B有519个等位基因，由于人是双倍染色体，理论上存在的HLA-B种抗原的数目为134,940种。HLA的多态性和其在免疫系统中发挥的重要作用，决定了不同个体的免疫系统可能因具有不同的HLA抗原分子而具有不同的免疫优势和劣势。HLA的多态性还会造成了器官移植和骨髓移植中的排斥反应，若供者和受者具有不同的HLA等位基因，在进行器官移植或骨髓移植后就会有比较强的免疫排斥反应发生，造成移植失败，因此，在移植前，必须对供者和受者进行高精度的HLA分型。自1958年发现第一个白细胞抗原，人们就开始对白细胞抗原进行分型，其方法也在不断进步。微量淋巴细胞毒试验70年代就发展成熟，并在以后成为实际上的白细胞抗原分型的技术标准，但由于这种方法分型只能对活细胞分型且错误率高，目前正逐渐被基于DNA技术的各种方法所取代。IHWG(International HistocompatabilityWorking Group，国际组织相容性工作组)目前推荐的分型方法主要有三种SSOP，SBT，SSP，其中以SSOP方法最受推崇。SSOP(SequenceSpecific Oligonucleotide Probe)即序列特异性寡核苷酸。这种方法灵敏度，特异性，稳定性都比较好，是目前几种方法中较优的一种，但也存在不少缺点，如操作时间比较长，大概需3个工作日；需昂贵设备等等。NMDP(National Marrow Donor Program)是美国国家骨髓库，其于1992-1993以及1997-1999年期间分别完成了对II白细胞抗原和I白细胞抗原分型方法由血清学技术(微量淋巴细胞毒试验)到基于DNA技术(SSOP)的转换。与血清学技术方法相比，各种基于DNA技术的各种方法确实有诸多优点，但这也带来了分型标准的混乱，世界各国的骨髓库和各地的分型实验室在使用不同的分型试剂与分型方法来进行白细胞抗原分型，各种分型试剂的分辨率稳定性都不相同，给数据的交流带来很多麻烦。基因芯片技术是最近于生物
内出现的一种新方法，它能高通量平行性的获得待测样本的大量信息，这是传统的生物学方法难以达到的。基因芯片由固相载体(一般为玻璃)和固定于其上的DNA探针组成，目前主要用于表达谱分析和突变检测两个领域。用于检测碱基突变的基因芯片的DNA探针的长度一般为十几个到二十几个碱基，其序列与待检测突变位点及突变位点两侧的序列互补，让待检测位点位于探针的中间位置(或接近中间)，根据待检测位点出现的碱基类型，设计几条探针分别与之完全互补，这样，在杂交时，待检测样品中的DNA会与序列与之完全匹配的探针结合，使该点有较强的荧光信号强度。根据各点荧光信号强度的不同，即可读出待检测样品中的DNA序列。由于HLA各等位基因之间的差异本质上是在多态性位点上的核苷酸的差异，可以利用基因芯片技术来对其进行分型，而且利用基因芯片技术对HLA分型有许多传统方法难以比拟的优势，比如操作简单，只需杂交扫描；效率高，杂交扫描能在两个小时内完成，而且可以在同一张芯片上同时分型好几份份样品；自动化程度高，扫描以后的工作都可以由计算机来处理；成本低，合成一次寡核苷酸探针可以点数千张芯片，每张芯片都可以检测几份样品。因此基于基因芯片技术的人类白细胞抗原分型方法很具有成为人类白细胞抗原分型技术标准的潜力。目前世界上已有不少公司及实验室在研究用基因芯片技术分型人类白细胞抗原的方法，但他们设计出的分型探针及由此生产的分型芯片都只达到中等分辨率水平，而基因芯片用人类白细胞抗原高分辨率分型探针的设计方法尚未有人描述，因为人类白细胞抗原高分辨率分型探针比较难以设计，这主要有两个原因第一，人类白细胞抗原的多态性非常丰富，在所有已发现的人类基因中其多态性最为丰富，如目前登录的HLA-B抗原的等位基因已达519条，而且人是双倍体，由HLA-B抗原的519条等位基因组成的合子与杂合子数目会达134940种之多，要对其设计高分辨率分型探针，是一件很艰巨的工作，需要大量运算。第二，人类白细胞抗原的多态性位点比较集中，I类白细胞抗原的多态性位点几乎都集中在第二和第三外显子的340bp内，II类白细胞抗原的多态性位点几乎都集中在第二外显子的260bp内。这些多态性位点，由于它们相互临近，在对其中一个多态性位点设计探针时总会受到临近多态性位点的干扰，若按照对孤立多态性位点设计探针的方法来进行设计，很难获得理想的探针，即便设计出了探针，也会对后面的探针调试，判定阀值确定带来诸多麻烦。
技术实现思路
本专利公开了一种人类白细胞抗原高分辨率、并且探针调试以及确定判定阀值容易的分型探针筛选及其应用方法，很好的解决了上述现有技术存在的问题。本专利技术的技术方案如下首先设计一种基因芯片用人类白细胞抗原分型探针的筛选方法，该方法包括如下步骤A.将人类白细胞抗原各等位基因的序列比对结果由网络中下载到计算机的存储器中，建立一个数据库；B.读取数据库中所有白细胞抗原多态性位点的信息；C.检测所有多态性位点，并将所有多态性位点按碱基位置相互临近的原则分为若干位点组；D.检索同一多态性位点组内出现的所有组合，比较每两种组合，找出碱基类型不相同的碱基位置形成新的数据组；E.根据数据组中每个多态性位点出现的情况确定分型探针的检测位点；F.根据探针的检测位点找出探针的序列；上述探针在基因芯片对人类白细胞抗原分型时的应用方法，包括以下步骤 ①以上述方法确定探针检测位点以及探针序列；②构建各等位基因对与各条探针匹配关系的判断程序；③合成探针并将探针置于固相载体上；④PCR扩增样品DNA，与芯片杂交并扫描；⑤由步骤②所建立的判断程序判别步骤④扫描出来的结果，将完全匹配的判断结果输出，从而确定待测样品的白细胞抗原型别。依据本专利技术中设计的人类白细胞抗原分型探针的筛选方法，提出了对多态性位点进行“分组”的解决方案，依此方法设计出来的分型探针，检测位点定位准确并且包容性较强，分辨率高。本专利技术的全部筛选过程全部由设计的一套计算机软件来执行，所以，可以快速准确地筛选出理想的分型探针。而且本专利还描述了各种匹配关系表的构建方法及如何根据这些匹配关系表一步步由芯片杂交结果判断出待测样品的白细胞抗原类型，解决了该分型探针在实际工作中的应用问题。附图说明图1是各组合之间的空间位置关系图。图2是各探针之间的空间位置关系图。具体实施例方式本专利技术的具体实施方式如下一种基因芯片用人类白细胞抗原分型探针的筛选方法，该方法包括如下步骤A.将人类白细胞抗原各等位基因的序列比对结果由网络中下载到计算机的存储器中，建立一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因芯片用人类白细胞抗原分型探针的筛选方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：Ａ．将人类白细胞抗原各等位基因的序列比对结果由网络中下载到计算机的存储器中，建立一个数据库；Ｂ．读取数据库中所有白细胞抗原多态性位点的信息； Ｃ．检测所有多态性位点，并将所有多态性位点按碱基位置相互临近的原则分为若干位点组；Ｄ．检索同一多态性位点组内出现的所有组合，比较每两种组合，找出碱基类型不相同的碱基位置形成新的数据组；Ｅ．根据数据组中每个多态性位点出现的 情况确定分型探针的检测位点；Ｆ．根据探针的检测位点找出探针的序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李志广，
申请(专利权)人：李志广，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]